2022年蛋白纯化方法大全及优缺点比较.docx
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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载蛋白纯化方法大全及优缺点比较1. 蛋白沉淀 蛋白能溶于水是由于其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处如溶液的离子强度特殊高或者特殊低,蛋白就倾向于从溶液中析出;硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性;硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分;蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳固, 可以短期在这种状态下储存中间产物,当前蛋白质纯化多采纳这种方法进行粗分离翻;在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强;其他的盐如硫酸钠
2、不存在这种问题,但其纯化成效不如硫酸铵;除了盐析外蛋白仍可以用多聚物如 PEG 和防冻剂沉淀出来,PEG 是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳固成效,在缓慢搅拌下逐步提高冷的蛋白溶液中的 PEG 浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期储存而不损坏;蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,由于它只能达到几倍的纯化成效,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化;其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培育基及细胞裂解物中解脱出来;2. 缓冲液的更换 虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用;不同的蛋白纯化方法需要不同pH 及不同离子强度的缓
3、冲液;假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来, 毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想方法脱盐, 可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用予大规模纯化中; 新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液, 并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平稳,如增加对蛋白溶液的压力,仍可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的;也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出, 从而使二者分别; 蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平稳的步骤
4、尤甚; 蛋白会结合在任何它能接触的表面上,很简单让蛋白失活;剪切力、 起泡沫和离子强度的快速变化名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载3.离子交换色谱 这是在全部的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法;基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过挑选不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合;树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂;蛋白质由
5、氨基酸组成,氨基酸在不同的 pH 环境中所带总电荷不同;大多数蛋白在生理pH(pH68)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的 pH 下蛋白会变性失活 .应尽量防止;由于在某个特定的 pH 下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或 pH 的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱;在工业化生产中更多地是转变盐浓度而不是去转变 pH 值,由于前者更简单掌握; 在试验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的帮助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来; 但在工业生产中盐浓度很难精确掌握,所以常用分步洗脱
6、而不足连续上升的盐梯度; 与排阻层析相比, 离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较廉价;值得一提的是,即便是用最精确掌握的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,仍需要其他的纯化步骤;4. 亲和层析 亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留,其他杂蛋白会流过柱子;本方法存在的问题是:单抗特别昂贵,而且也需先纯化;单抗与目的蛋白结合力太强 .要用苛刻的条件来洗脱,这会使目的蛋白失活并破坏单抗;混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合;某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中,也需要从终产物中去除;亲和柱通常在纯化过程的后
7、期应用,此时标本体积已缩小,大部分的杂质已经去除;谷胱甘肽S-转移酶( Glutathione S-transferase,GST)是最常用的亲和层析纯化标签之一,带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化,但本方法有以下缺点:第一,蛋白上的GST 必需能合适地折叠,形成与谷胱甘肽结合的空间结构才名师归纳总结 能用此方法纯化;其次,GST 标签多达 220 个氨基酸,如此大的标签可能会影响表达蛋白第 2 页,共 5 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载的可溶性, 使形成包涵体,这会破坏蛋白的自然结构,难于进行结构分析,有时即便
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