第十三章-酶类药物的分析优秀PPT.ppt

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1、第一节第一节概述概述n在在生生物物体体内内，酶酶能能降降低低生生化化反反应应活活化化能能，加加快快可可逆逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡。反应的进行速度，使之尽快达到平衡。n一、酶的特性一、酶的特性n二、酶的分类二、酶的分类n三、酶的化学组成三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学1一、酶的特性一、酶的特性1酶是高效催化剂。酶是高效催化剂。2酶对底物的结构具有严格的选择性。酶对底物的结构具有严格的选择性。（1）相对专一性：）相对专一性：（2）确定专一性）确定专一性:（3）立体异构专一性）立体异构专一性:3酶催化反应的反应条件温顺。酶

2、催化反应的反应条件温顺。4酶酶的的催催化化活活性性在在生生物物体体内内受受多多种种因因素素的的调整。调整。2二、酶的分类二、酶的分类n氧化还原酶氧化还原酶n转移酶转移酶n水解酶水解酶n裂合酶裂合酶n异构酶异构酶n合成酶（或称连接酶）合成酶（或称连接酶）3三、酶的化学组成三、酶的化学组成n分为简洁酶和结合酶两大类。分为简洁酶和结合酶两大类。n结结合合酶酶类类中中除除含含有有蛋蛋白白外外，还还含含有有某某种种热热稳稳定定的的非非蛋蛋白白质质的的小小分分子子物物质质，二二者者结结合合起起来来，称称为为“全酶全酶”，才呈现生物催化活性。，才呈现生物催化活性。n结合酶结合酶 =酶蛋白酶蛋白+协助因子协助

3、因子4四、酶的催化反应机制四、酶的催化反应机制n1酶酶-底底物物复复合合物物的的形形成成在在酶酶促促反反应应中中，反反应应底底物物首首先先与与酶酶分分子子上上活活性性部部位位结结合合，形形成成酶酶-底底物物复复合合物物，降降低低反反应应的的活活性性能能，使使酶酶促促反反应应顺顺当当进行。进行。n2酶酶-底物复合物加速反应速率的缘由底物复合物加速反应速率的缘由n（1）定向作用与底物浓缩）定向作用与底物浓缩n（2）酶使底物分子变形）酶使底物分子变形n（3）酸碱催化）酸碱催化n（4）共价催化）共价催化。5五、酶催化反应动力学五、酶催化反应动力学n酶酶的的活活力力单单位位 酶酶活活性性单单位位（U）是

4、是酶酶活活性性凹凸的一种量度，用凹凸的一种量度，用U/g或或U/ml表示。表示。n酶酶活活力力单单位位定定义义：在在规规定定的的条条件件下下，每每分分钟钟能能转转化化1mol底底物物所所须须要要的的酶酶量量，称称一一个个酶的活力单位。酶的活力单位。n酶酶的的比比活活力力 每每毫毫克克酶酶蛋蛋白白所所含含酶酶活活力力，U/mg。6Michaelis-MentenMichaelis-Menten快速平衡学说快速平衡学说n底底物物浓浓度度的的增增加加，反反应应速度上升呈速度上升呈双曲线双曲线。n在在低低底底物物浓浓度度时时，反反应应速速度度呈呈直直线线上上升升，表表现现为为一级反应一级反应。n在在高

5、高浓浓度度时时，反反应应速速度度达达到到一一个个极极限限值值，呈呈现现零级反应零级反应。7米氏方程米氏方程n酶反应动力学方程式：酶反应动力学方程式：nV反应初速度反应初速度nVm最大反应速度最大反应速度nKs 米米氏氏常常数数，Ks=K1/K1，Ks为为ES的的解解离离常常数数，表示酶与底物的亲和力表示酶与底物的亲和力。nKs为为反反应应速速度度V是是最最大大反反应应速速度度Vm一一半半时时所所需需底底物物浓浓度，即度，即V=1/2Vm时，时，Ks=S。8Briggs-Haldane稳态学说稳态学说nES的的形形成成速速度度与与ES的的解解离离速速度度相相等等，达达到到动动态态平平衡衡，即，即

6、“稳态稳态”，反应方程式：，反应方程式：nKm取代了取代了Ks，当当V=1/2Vm时，时，Km=S。nKm也可表示为底物与酶的亲和力。也可表示为底物与酶的亲和力。9其次节其次节 酶类药物的鉴别与检查酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反应。下的双缩脲反应。n专用于酶的鉴别方法：专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）。酶）。n 沉淀试验：胃蛋白酶沉淀试验：胃蛋白酶n 动物试验：透亮质酸酶水解粘多糖。动物试验：透亮质酸酶水解粘多糖。10酶类药物的检查酶类药物的检

7、查n酶酶类类药药物物是是生生化化产产品品和和微微生生物物发发酵酵产产品品，在在生生产产过过程程中中可可能能带带入入微微量量的的脂脂肪肪类类物物质质、其其他他的的酶酶类类和和大大分分子子杂杂质质，影影响响酶酶质质量量，需需有有含量限度。含量限度。11酶类药物的检查酶类药物的检查n（一）脂肪含量限度检查一）脂肪含量限度检查n检检查查方方法法，乙乙醚醚浸浸提提，干干燥燥，精精密密称称定定，脂脂肪肪不得过规定的含量。不得过规定的含量。n（二）其他酶类含量限度检查（二）其他酶类含量限度检查n胰胰蛋蛋白白酶酶、糜糜蛋蛋白白酶酶均均是是从从牛牛、猪猪的的胰胰脏脏中中提提取取的的蛋蛋白白分分解解酶酶。提提取取

8、胰胰蛋蛋白白酶酶时时又又易易带带入入微微量的糜蛋白酶量的糜蛋白酶。n（三）大分子活性物质含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查12胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每每2500U胰蛋白酶中不得多于胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。的糜蛋白酶。n糜蛋白酶专属水解糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸芳香氨基酸（L-酪氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸）苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。n用用N-乙酰乙酰-L-酪氨酸乙酯酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通过）作底物，通过分光光度法测定此分光光

9、度法测定此酶对底物的水解速率酶对底物的水解速率来检查来检查该酶的含量限度。该酶的含量限度。13第三节第三节 酶活力测定方法酶活力测定方法n固定时间法固定时间法 n连续监测法连续监测法 n （一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监作指示的连续监测法：测法：n 干脆测定法干脆测定法 n 偶联法偶联法n 三联酶活测定三联酶活测定n （二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续作指示的连续监测法：监测法：n固定浓度法固定浓度法 14一、固定时间法一、固定时间法n在适宜的条件下，使酶和底物共同保温确定在适宜的条件下，使酶和底物共同保温确定时间，然后测定产物生成的量或底物消耗

10、的时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量（或活力）。量从而间接推算出酶的含量（或活力）。n nE表示酶浓度，表示酶浓度，P为反应产物浓度，为反应产物浓度，t 表示表示酶作用时间，酶作用时间，K为常数。为常数。15留意事项留意事项n缺缺点点：无无法法了了解解整整个个反反应应过程是否都是零级反应。过程是否都是零级反应。n留意事项：留意事项：n1、底物饱和、底物饱和n2、时间、时间16二、连续监测法二、连续监测法n在酶反应过程中，在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量或产物生成量。n（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示

11、的连续监测法作指示的连续监测法n（二）、不需（二）、不需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法作指示的连续监测法17（一）、需（一）、需NAD+或或NADP+作指示的连续监测法：作指示的连续监测法：n还原型辅酶（还原型辅酶（NADH和和NADPH）在）在340nm处有处有紫外吸取，氧化型辅酶（紫外吸取，氧化型辅酶（NAD+和和NADP+）在）在340nm处无紫外吸取处无紫外吸取.n利用利用340nm处每分钟吸取度上升或降低的速率与处每分钟吸取度上升或降低的速率与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。n包括：包括：n 干脆测定法干脆测定法 n 偶联法偶

12、联法n 三联酶活测定三联酶活测定 18干脆测定法干脆测定法n大大多多数数需需NADH（NADPH）参参与与的的脱脱氢氢酶酶，可可利利用用紫紫外外分分光光光光度度法法干干脆脆测测定定反反应应体体系系在在340nm处吸取度的变更，计算酶活力单位。处吸取度的变更，计算酶活力单位。n丙酮酸丙酮酸NADHH+乳酸乳酸NAD+n340nm处处吸吸取取度度降降低低的的速速率率与与NADH的的氧氧化化速速率成正比，与率成正比，与LDH的活力成正比。的活力成正比。19偶联法偶联法n此类酶催化反应不需此类酶催化反应不需NAD+或或NADP+，但当与需但当与需NAD+或或NADP+的脱氢酶反应偶联的脱氢酶反应偶联以

13、后，能用以后，能用紫外紫外分光光度法测定分光光度法测定.n由脱氢酶引起的反应为由脱氢酶引起的反应为指示反应指示反应，脱氢酶是指示酶，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍倍。n例如：谷草转氨酶的测定：例如：谷草转氨酶的测定：20三联酶活测定三联酶活测定n引引入入一一个个协协助助酶酶反反应应，将将被被测测酶酶反反应应系系统统与与指指示示酶酶反反应应系系统统联联系系起起来来，组组成成一一个个“三三合合一一”酶酶反反应应系系统统，使使底底物物转转化化率率、协协助助酶酶反反应应和和NADH（NADPH）氧氧化化速速率率之之间间成成正正比比函函数数关关系系，

14、协协助酶和指示酶的活力必需大大超过测定酶活力。助酶和指示酶的活力必需大大超过测定酶活力。n例如：磷酸肌酸例如：磷酸肌酸+ADP 肌酸肌酸ATP (1)n 葡萄糖葡萄糖ATP G-6-P ADP (2)nG-6-P +NADP+葡葡萄萄糖糖酸酸-6-磷磷酸酸 NADPH H+(3)n(1)被被测测反反应应，(2)协协助助反反应应，HK（己己糖糖激激酶酶）协协助助酶酶，(3)指指示示反应，反应，G-6-PDH（6磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。21（二）不需（二）不需NAD+或或NADP+指示的连续监指示的连续监测法：测法：n酶底物大多是人工合成的酶底物大多是人工合成的“色素元

15、色素元”，其本，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物。身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物。依据反应过程中吸取度增高速率，算出酶活依据反应过程中吸取度增高速率，算出酶活力单位。力单位。n例如：例如：n磷酸对硝基苯酚酯磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚对硝基苯酚22三、固定浓度法三、固定浓度法n依依据据酶酶催催化化反反应应，使使反反应应产产物物达达到到额额定定的的浓浓度度时时其其反反应应时时间间与与酶酶浓浓度度成成反反比比的的原原理理进进行行设计的。设计的。n P=KEtn测定时间测定时间.n以以所所需需时时间间的的倒倒数数（1/t）对对酶酶浓浓度度作作图图即即可可制备标准曲线。制备标准曲线。

16、n优点：优点：1、记录时间。、记录时间。2、精确、精确23二、底物与产物的测定方法二、底物与产物的测定方法（酶反应的检酶反应的检测方法测方法）1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变更值。、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变更值。2、分光光度法：、分光光度法：常用的有比色法和紫外分光光度法。常用的有比色法和紫外分光光度法。3、荧光测定法：、荧光测定法：简洁、灵敏、快速。简洁、灵敏、快速。4、电化学分析法、电化学分析法（1）离子选择性电极分析法离子选择性电极分析法（2）微电流法微电流法5、其他方法、其他方法如测定气体的测压法，测定产物旋光度变更值的旋光测定法。如测定气体的测压法

17、，测定产物旋光度变更值的旋光测定法。24第五节第五节酶类药物的检测酶类药物的检测n肽键水解酶肽键水解酶n 1、胰蛋白酶胰蛋白酶n 2、弹性蛋白酶弹性蛋白酶n 3、尿激酶尿激酶（气泡上升法气泡上升法）n脂键水解酶脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n糖苷键水解酶糖苷键水解酶溶菌酶溶菌酶n其它其它（超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶）25一、肽键水解酶一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶、弹性蛋白酶n3、尿激酶、尿激酶261、胰蛋白酶、胰蛋白酶比色法比色法n胰胰蛋蛋白白酶酶：由由牛牛、羊羊、猪猪等等动动物物的的胰胰脏脏中中提提取取的一种蛋白水解酶的一种蛋白水解酶。n牛牛胰胰蛋蛋白白酶酶：233个

18、个氨氨基基酸酸，分分子子量量24000，等电点等电点10.1。n猪猪胰胰蛋蛋白白酶酶：214个个氨氨基基酸酸，分分子子量量23400，等电点等电点10.8。n胰胰蛋蛋白白酶酶最最适适pH为为7.68.0，电电泳泳纯纯的的胰胰蛋蛋白白酶的比活为酶的比活为8000单位单位/mg。27原理原理n胰胰蛋蛋白白酶酶专专一一作作用用于于赖赖氨氨酸酸、精精氨氨酸酸等等碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基组组成成的的肽肽键键、酰酰胺胺键键及及酯酯键键，水水解解速速度度为为酯酯键键酰酰胺胺键键肽键。肽键。nBAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)nBAA(Benzoyl-L-Argi

19、nine-Anide)n苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸乙乙酯酯（BAEE）在在胰胰蛋蛋白白酶酶的的作作用用下下，酯酯键键被被水水解解生生成成苯苯甲甲酰酰L精精氨氨酸酸，在在253nm波波特特长长的的吸取度随酶促反应递增，依据活力单位定义计算酶活力。吸取度随酶促反应递增，依据活力单位定义计算酶活力。28测定法：测定法：n取呈直线的吸取度，按下式计算：取呈直线的吸取度，按下式计算：nP为为每每mg供供试试中中含含胰胰蛋蛋白白酶酶的的量量，U；A1为直线上终止的吸取度；为直线上终止的吸取度；nA2为直线上起先的吸取度；为直线上起先的吸取度；nT为为A1至至A2读数的时间，读数的时间，min；nW为测定液

20、中供试品的量，为测定液中供试品的量，mg；n吸吸取取度度每每分分钟钟变变更更0.003，即即相相当当于于1个胰蛋白酶单位个胰蛋白酶单位。292、胰胰弹性蛋白酶弹性蛋白酶n胰弹性蛋白酶：胰弹性蛋白酶：为肽链内断酶为肽链内断酶，存在于哺乳动物，存在于哺乳动物胰脏。胰脏。n弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪弹性酶用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化和脂肪肝。肝。n胰弹性蛋白酶是由胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链，个氨基酸组成的单一肽链，有四对二硫键。分子量为有四对二硫键。分子量为25900，等电点为等电点为pH9.5。n胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外，还可以水解血胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋

21、白外，还可以水解血红蛋白、酪蛋白等蛋白。红蛋白、酪蛋白等蛋白。n刚果红弹性蛋白刚果红弹性蛋白。30原理原理n刚果红弹性蛋白法：以刚果红弹性蛋白为底物，由刚果红弹性蛋白法：以刚果红弹性蛋白为底物，由于刚果红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，于刚果红弹性蛋白酶结合的共价键能被弹性酶水解，依据刚果红在依据刚果红在495nm处有最大吸取，由标准曲线即可查处有最大吸取，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。得弹性酶单位数。n单位：单位：20分钟水解分钟水解1mg刚果红弹性蛋白所需的酶量为刚果红弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。一个弹性酶活力单位。31方法方法:n323、尿激酶、尿激酶n由人尿中分别提

22、纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。由人尿中分别提纯后制得的一种碱性蛋白水解酶。n主要作用是激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其成主要作用是激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其成为有活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，为有活性的纤维蛋白溶酶，从而解聚血纤维蛋白，溶解血栓。溶解血栓。n自然尿激酶的分子量为自然尿激酶的分子量为54000，其作用于纤维蛋，其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。蛋白溶解酶。33效价测定原理效价测定原理(气泡上升法气泡上升法)n尿激酶激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶；尿激酶激活人体内纤维蛋白溶解酶

23、原使其转化成纤维蛋白溶酶；n纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。n在纤维蛋白溶酶原过量的状况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间在纤维蛋白溶酶原过量的状况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。的对数成直线关系。34操作操作n试管中加纤维蛋白原溶液试管中加纤维蛋白原溶液0.3ml（37水浴）水浴）n标准品溶液标准品溶液1.0mln加混合溶液加混合溶液0.4mln马上摇匀计时，反应系统应在马上摇匀计时，反应系统应在304

24、5秒内凝合，秒内凝合，当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。终点。n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。纵坐标。35二、脂键水解酶二、脂键水解酶胰脂肪酶胰脂肪酶n胰脂肪酶是一种水解酶，在确定条件下把甘胰脂肪酶是一种水解酶，在确定条件下把甘油三脂类脂肪逐步水解，最终生成甘油及相油三脂类脂肪逐步水解，最终生成甘油及相应的脂肪酸。应的脂肪酸。n底物底物:橄榄油橄榄油npH指示连续滴定法：稳定指示连续滴定法：稳定pH条件下避开因条件下避开因pH值变更而引起酶活力的变更。值变更而引起酶活力的变更。

25、n用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测用已知浓度的标准碱溶液滴定，可定量地测定脂肪酸的量，从而得知脂肪酶活力。定脂肪酸的量，从而得知脂肪酶活力。36测定测定n37计算计算n每分钟每分钟水解橄榄油水解橄榄油产生产生1mol脂肪酸脂肪酸的酶量，的酶量，为为1个活力单位。个活力单位。n每克含有的胰脂肪酶单位每克含有的胰脂肪酶单位nA:供试品消耗供试品消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nB:空白消耗空白消耗NaOH（0.1mol/L）的体积）的体积nW:供试品取样量（供试品取样量（g）nN:供试品稀释倍数。供试品稀释倍数。38三、糖苷键水解酶三、糖苷键水解酶溶菌酶溶菌酶n蛋清中提取的能蛋

26、清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶分解粘多糖的碱性水解酶。n主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖主要作用于革兰氏阳性菌，使胞壁中的肽聚糖分解导致细菌溶解。分解导致细菌溶解。n溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒等作用。n溶菌酶分子量为溶菌酶分子量为1400015000，由，由129个氨基个氨基酸残基组成，等电点为酸残基组成，等电点为10.011.1。n溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的溶菌酶属糖苷水解酶，能以某些细菌细胞中的多糖为底物。多糖为底物。39效价测定比浊法效价测定比浊法n以溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多以溶酶小球菌为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由

27、糖由NAG和和NAM重复而成。重复而成。n溶菌酶水解专属性强，它只能水解溶菌酶水解专属性强，它只能水解NAMC1和和NAGC4之间的之间的1，4糖苷键。糖苷键。n溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解作用后，菌体因渗透压不平衡，导致溶菌，溶液的用后，菌体因渗透压不平衡，导致溶菌，溶液的吸取度下降。吸取度下降。n在确定的条件下，每分钟吸取度下降在确定的条件下，每分钟吸取度下降0.001为一为一个酶活力单位。个酶活力单位。40比浊法测定比浊法测定n计算：计算：n酶活力单位（酶活力单位（u/mg）=nW为测试液中供试品为测试液中供试品的重量（的重量（g）4

28、1比色法测定溶菌酶活性比色法测定溶菌酶活性n用用 染染 料料 艳艳 红红 K 2BP标标 记记 的的M.Lysodeikticus为为底底物物，酶酶催催化化细细胞胞壁壁分分解解时时游游离离出出染染色色碎碎片片（产产物）物）n反反应应后后离离心心除除去去未未分分解解底底物物，上上清清液液比比色色，吸吸取取度度为为溶溶菌菌酶酶活活力力的的函函数。数。42溶菌酶效价测定比色法溶菌酶效价测定比色法n43四、超氧化物歧化酶四、超氧化物歧化酶n由哺乳动物红细胞分别而得的金属酶，能催由哺乳动物红细胞分别而得的金属酶，能催化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧。化超氧化物游离基转化成过氧化氢和氧。n来源于牛、猪、

29、人红血球的超氧化物歧化酶来源于牛、猪、人红血球的超氧化物歧化酶（SOD）含铜和锌，分子量）含铜和锌，分子量32000左右。左右。nSOD对热较稳定，在对热较稳定，在pH5.39.5范围内对范围内对酶活性影响不大。酶活性影响不大。n牛红细胞牛红细胞SODPI为为4.95。44效价测定效价测定nSOD测定方法：测定方法：n干脆法：干脆测定反应过程中干脆法：干脆测定反应过程中 O2-的变更。的变更。n间接法：同时运用氧自由基指示清除剂，间接法：同时运用氧自由基指示清除剂，SOD与指与指示剂清除剂竞争示剂清除剂竞争O2-，从而抑制指示剂清除剂与，从而抑制指示剂清除剂与O2-的结合，依据指示剂清除剂与的

30、结合，依据指示剂清除剂与O2-反应速度的变更可反应速度的变更可间接测定间接测定SOD的活性。的活性。n间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素C法和联苯三法和联苯三酚法。酚法。45黄嘌呤氧化酶细胞色素黄嘌呤氧化酶细胞色素C法法n原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生尿酸，与此同时产生O2-，氧化型细胞色素，氧化型细胞色素C被被O2-还原为还原型细胞色素还原为还原型细胞色素C，后者在，后者在550nm有最大吸取，有最大吸取，因此测定氧化性细胞色素因此测定氧化性细胞色素C在加入在加入SOD前后的光吸取前

31、后的光吸取变更可间接计算酶活性。变更可间接计算酶活性。46方法方法n 47留意点留意点n在特定条件下，在特定条件下，25（pH7.8）每分钟抑制细）每分钟抑制细胞色素胞色素C还原速率达还原速率达50所须要的酶量为一个活所须要的酶量为一个活力单位。力单位。n留意事项：留意事项：n重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活，因此反应体系中必需添加系中必需添加EDTA。n反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。发生过氧化作用，从而干扰检测的正确。48联苯三酚法联苯三酚法n原理：在碱性条件下

32、，联苯三酚会发生自氧化原理：在碱性条件下，联苯三酚会发生自氧化生成红生成红酚，同时生成酚，同时生成O2-。n定义定义:在确定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧在确定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达化速率达50的酶量为一个酶活力单位。的酶量为一个酶活力单位。49操作操作n定义定义:在确定条件下，每分钟抑制联苯三酚自在确定条件下，每分钟抑制联苯三酚自氧化速率达氧化速率达50的酶量为一个酶活力单位。的酶量为一个酶活力单位。50实例：尿激酶（实例：尿激酶（urokinase）n本本品品系系从从簇簇新新人人尿尿中中提提取取的的一一种种激激活活纤纤维维蛋蛋白白溶酶原的酶。溶酶原的酶。n由由高高分分子子量

33、量54000和和低低分分子子量量33000组组成成的的混混合合物物，高高分分子子量量含含量量不不得得少少于于90%，每每1mg蛋蛋白白中尿激酶活力不得少于中尿激酶活力不得少于12万万U，蛋白分解药物。，蛋白分解药物。51尿激酶尿激酶n（一）性状（一）性状n本品为白色非结晶状粉末本品为白色非结晶状粉末n（二）鉴别（二）鉴别n取取比比活活力力测测定定项项下下的的供供试试品品溶溶液液，用用巴巴比比妥妥-氯氯化化钠钠缓缓冲冲液液（pH7.8）稀稀释释成成每每1ml中中含含20U的的溶溶液液，吸吸取取1ml，加加纤纤维维蛋蛋白白原原溶溶液液0.3ml，再再依依次次加加入入纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原溶溶

34、液液0.2ml，凝凝血血酶酶溶溶液液0.2ml，快快速速摇摇匀匀，马马上上置置370.5恒恒温温水水浴浴中中保保温温，记记时时，反反应应系系统统应应在在3045s内内凝凝合合，且且凝凝块块在在15min内内重重新新溶溶解解。以以0.9%氯氯化化钠钠溶溶液液作作空空白白，同同法法操操作作，凝凝块块在在2h内内不溶。不溶。52（三）检查（三）检查n1溶液的澄清度与颜色，溶液的澄清度与颜色，应澄清无色。应澄清无色。n2分分子子组组分分比比取取本本品品，加加水水制制成成每每1ml中中含含2mg的的溶溶液液后后，加加入入等等体体积积的的缓缓冲冲液液（取取浓浓缩缩胶胶缓缓冲冲液液2.5ml，20%十十二二

35、烷烷基基磺磺酸酸钠钠溶溶液液2.5ml，20%十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠溶溶液液的的10ml），置置水水浴浴中中3min，放放冷冷，作作为为供供试试品品溶溶液液；取取供供试试品品溶溶液液10l，加加至至样样品品孔孔，照照电电泳泳法法测测定定，按按下下式式计计算算高高分分子子尿尿激激酶酶相相对对含含量（量（%）。）。53（三）检查（三）检查n3干干燥燥失失重重取取本本品品，以以五五氧氧化化二二磷磷为为干干燥燥剂剂，在在60减压干燥至恒重，减失重量不得过减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%。n4异异样样毒毒性性取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含5000U的的溶

36、溶液液，依依法法检检查查，按按静静脉脉注注射射法法给给药药，应符合规定。应符合规定。n5热热原原取取本本品品，加加氯氯化化钠钠注注射射液液制制成成每每1ml中中含含20000U的的溶溶液液，依依法法检检测测，按按家家兔兔体体重重每每1kg注注射射1ml，应符合规定。，应符合规定。546.凝血质样活性物质凝血质样活性物质n（1）血浆的制备）血浆的制备 。n（2）复复钙钙试试验验 取取小小试试管管，加加血血浆浆0.1ml、6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液0.1ml及及巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液0.1ml，再再加加入入氯氯化化钙钙溶溶液液视视察察凝凝固固时时间间。以以凝凝固固时时间间最最短短的的一一管管所

37、所加加的氯化钙量，为复钙试验的氯化钙溶液用量。的氯化钙量，为复钙试验的氯化钙溶液用量。n（3）测测定定法法 取取小小试试管管加加入入上上述述倍倍比比稀稀释释的的供供试试品品溶溶液液各各0.1ml，再再依依次次加加入入上上述述6-氨氨基基己己酸酸溶溶液液和和血血浆浆各各0.1ml，轻轻轻轻摇摇匀匀，在在25水水浴浴中中，静静置置23min，快快速速加加入入已已预预温温至至25的的复复钙钙试试验验所所需需的的上上述述氯氯化化钙钙溶溶液液用用量量，混混匀匀，记记录录放放入入时时间间。留留意意视视察察血血浆浆凝凝固固，视视察察时时轻轻轻轻倾倾斜斜，避避开开影影响响凝凝血过程，记录凝固时间。血过程，记录

38、凝固时间。n空白比照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于复钙试验凝固缩短时间。空白比照管凝固时间减去供试品管凝固时间等于复钙试验凝固缩短时间。n在在单单对对数数纸纸上上，以以供供试试品品溶溶液液的的浓浓度度为为纵纵坐坐标标，以以复复钙钙试试验验凝凝固固缩缩短短时时间间（s）为为横横坐坐标标，绘绘图图，连连接接不不同同稀稀释释度度的的供供试试品品各各点点，应应成成始始终终线线，此此直直线线外外延延至至纵纵轴轴，与与纵纵轴轴的的交交点点即即表表示示供供试试品品浓浓度度，也也是是凝凝血血质质样样活活性性为为零零值时的供试品酶活力，按每值时的供试品酶活力，按每1ml中供试品的单位表示，每中供试品的单位表

39、示，每1ml应大于应大于150U。55（四）（四）效价测定效价测定(气泡上升法气泡上升法)n原理：激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶，原理：激活人体内纤维蛋白溶解酶原使其转化成纤维蛋白溶酶，因纤维蛋白溶酶具有较强的蛋白水解酶的实力。因纤维蛋白溶酶具有较强的蛋白水解酶的实力。n纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的状况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数酶原过量的状况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。成直线关系。56操作操作n57计算：计算：n以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。为纵坐标。n留意：留意：n影响效价测定的主要因素是纤维蛋白溶解酶原、影响效价测定的主要因素是纤维蛋白溶解酶原、凝血酶及纤维蛋白原，如发觉标准曲线斜率低凝血酶及纤维蛋白原，如发觉标准曲线斜率低于于0.3，直线平坦，则纤维蛋白溶解酶原、凝，直线平坦，则纤维蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新标定或更换。血酶可能失活，需重新标定或更换。n效价测定过程中，各试剂需置效价测定过程中，各试剂需置37水浴中。水浴中。58