实时荧光定量PCR.ppt

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1、实时荧光定量PCR Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 专专 业：业：生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学 姓姓 名：名：王梦圆王梦圆 学学 号号：2013211026 1、定义、定义 2、概念和原理、概念和原理 3、染料、染料 定义定义 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的局限性电泳分析方法的

2、局限性只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事无法对扩增反应实时监测实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。PCRPCR反应混合物反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质主要亮点

3、主要亮点 实时实时 定量定量怎样实现实时定量？这是应为在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，借助RT-PCR仪绘制出的曲线对起始模板进行定量分析。借助荧光物质示踪扩增产物量的变化。RT-PCR中重要概念和原理扩增曲线：扩增曲线：荧光扩增曲线可以分成四个阶段：荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段 荧光信号线性扩增阶段 平台期重要概念和定量原理扩增曲线：基线基线:在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。荧光阈值：荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一

4、般我们将荧光域值的缺省设置在 3-15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍。Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度（荧光强度）Baseline1荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光阈值荧光阈值平台期平台期Lgliner phaseCT值：值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct value Ct值值浓度低浓度低浓

5、度低浓度低浓度高浓度高浓度高浓度高起始模板差10倍，Ct值差3.3。CTCT值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？哪个样品浓度高？0 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。染料染料实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。SYBR Green I染料法染料法原理原理SYBR Green I是一种结合于所有DNA双螺旋小沟

6、区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I热热热热 变变变变 性性性性引物退火引物退火引物退火引物退火延伸反应延伸反应延伸反应延伸反应SYBR Green I 染料法染料法作用机理作用机理问题点：问题点：SYBR Green I与双链与双链DNA进行结合后散发荧光，因进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。也将同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。解决办法：解决办法：利用荧光染料可

7、以指示双链利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析非特异扩增。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由由 SYBR Green I 得到定量结果。得到定量结果。SYBR Green I染料法染料法问题问题及解决办法及解决办法融解曲线分析融解温度TM非特异扩增产物目的基因产物Taqman探针法探针法原理原理+5端标记有报告基团(Reporter,R)+3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)+探针完整，R发射

8、的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光+Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan 探针是多人拥有的专利技术。TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因子与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离而发出荧光。分子信标（分子信标（molecular beacon）原理原理分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构

9、的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开而发荧光。几种方法的应用比较几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBR Green I 方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析Thank you！