2022年生物下游技术重点总结.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 生物下游技术重点总结：其次章：为什么要进行发酵液预处理？处理的目标及内容分别是什么？最终目的就是要有利于后续的分别纯化的进行,由于发酵液中黏性大,固体颗粒多 复杂,目标产物在发酵液中浓度特别低,必需通过一系列的处理才行发酵液金属离子的去除方法分别有哪些？杂蛋白去除的方法和机理分别是什么？草酸处理钙离子和镁离子生成草酸钙和草酸镁,三额离聚磷酸钠处理镁离子形成络 合物,黄血盐处理铁离子产生普鲁士沉淀等；杂蛋白去除的方法有 等电点法 ,有机 溶剂法,加热法,盐析法 ,吸附法,其他分别法等；发酵液处理性能的改善有哪些方法？降低黏度,可以用加热和稀释法；

2、调剂 絮凝和凝结的概念、机理分别是什么？PH；调剂温度；絮凝处理等絮凝是指高分子的絮凝剂的作用下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝颗粒的 过程,这是一种以物理集合为主的过程 凝结是指在中性盐的作用下,双电层的排斥点位下降,使胶体体系不稳固的,使微 粒相互黏在一起的现象有哪些絮凝剂可以使用？高聚物、无机盐、有机溶剂和表面活性剂第七章液相色谱：液相色谱： 色谱法也叫层析法,它是一种高效能的物理分别技术,将它用于分析化学并协作适当的检测手段,就成为色谱分析法；用液体作为流淌相的色谱法；色谱法的原理：1、色谱法是一种分别技术,是混合物最有效的分别、分析方法；2、试样混合物的分别过程也就是试样中各组分

3、在称之为色谱分别柱中的两相间不断进行着 的安排过程；3、其中的一相固定不动,称为 固定相 ；4、另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体）,称为 流淌相 5、当流淌相中携带的混合物流经固定相时,其与固定相发生相互作用；由于混合物中各组 分在性质和结构上的差异,与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同,随着流淌相 的移动,混合物在两相间经过反复多次的安排平稳,使得各组分被固定相保留的时间不 同,从而按肯定次序由固定相中流出；6、 与适当的柱后检测方法结合,实现混合物中各组分的分别与检测；7、两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础色谱的一般过程：名师归纳总结 A 色谱柱 column

4、：第 1 页,共 21 页B 固定相 stationary phase ：C 流淌相 flow phase ：D 洗脱液 elution ：E 检测器 detector ：F 部分收集器 portion collector - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 色谱的分类：一,按应用的目的分类：A、 制备性色谱 preparation Chromatography ：工业规模,试验室规模B、 分析性色谱 analytical Chromatography ：GC、LC、HPLC、TLC等二,按流淌相分类：A、GC: 气-固色谱法固定相为固体 气-液色谱法将

5、不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相B 、 LC 液-固色谱固定相为固体 液-液色谱液体固定相固定在适当的固体上三,按色谱的绽开形式：A、柱色谱法B、毛细管色谱法C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱四,按分别操作方式：A、洗脱法B、置换法C、迎头法五,按原理分类：国际通用色谱法分类及缩写名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 色谱的名词术语：安排系数 m：m c sc m 式中, cs和 cm 分别为组份在固定相和流淌相中的浓度；意义：简洁懂得,溶质流过色谱柱时,m 大的组份通过色谱柱所需要的时间长,m 小的组份需

6、要的时间短；当样品中各组份在两相的 的；m 不同时,就能实现差速迁移,达到分别的目基线： 当没有样品进入检测器,在试验条件下,检测器输出不变的电压和电流信号；稳固的基线是一条平行于时间横坐标的直线,如图中的 CD线；峰高： 以 h 表示, 组分从柱后洗出最大浓度时检测器输出的信号值,及色谱顶点向基线作垂名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 直的距离,图中AB 所示,色谱峰高一般用毫伏（mV 、毫米（ mm、或检测器输出的信号单位表示保留值：死时间 tm : 不被固定相吸附或溶解的组份,即非滞留组份（如空气或甲烷）从进样

7、开头到色谱峰顶（即浓度极大）所对应的时间 相的流淌速度相近由于物质不被固定相吸附,故其流淌速度将与流淌保留时间 tr : 溶质通过色谱柱所需要的时间,即从进样到柱后洗处组份浓度最大值的时间,以 tR 表示；tr意义 ：色谱法定性的基本依据,但同一组份的 者有时用保留体积等参数进行定性检定；t r常受到流淌相流速的影响,因此色谱工作调整保留时间 tr : 溶质通过色谱柱的保留时间包括她在色谱柱流淌相和固定相所消耗的时间；组份在流淌相消耗的时间基本相同,因而定义溶质固定相中滞留的时间（即从保留时间扣除死时间）称为该组份的调整保留时间,以 tR 表示死体积 VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、

8、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和,当后两项很小而可忽视不计时,VM 可由t m 与流淌相体积流速F0ml/min 运算：保留体积 VR：指从进样开头到被测组份在柱后显现浓度极大点时所通过的流淌相体积；保留体积与 t r 的关系如下：调整保留体积 VR：某组份 VR扣除 VM后,称该组份的 VR ,即相对保留值 2,1：某组份 2 与组份 1 的调整保留值之比,即：由于 2,1 只与柱温及固定相的性质有关,而与柱径、柱长、填充情形及流淌相流速无关,因此,它是色谱法中,如 GC、 HPLC中,广泛使用的定性数据；留意： 2,1 绝不是两个组份保留时间或保留体积之比安排比 k, 即

9、容量因子：k 与 m 的关系：kc i,s V sm iV s意义：色谱柱对组份保留才能的重要参数c i,m V mV m区域宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数,素；度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：它反映了色谱操作条件的动力学因A、标准差：0.607 倍峰高处峰宽的一半；即图 EF的二分之一B、半峰宽 Y1/2：峰高一半处对应的峰宽；它与 的关系为 即图中 GH 的 1/2 C、基线宽度 Y：也叫色谱峰底宽,色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距；它与 的关系是,即图中 TJ长度色谱曲线反映出的重要信息：名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 21 页精选学习资

10、料 - - - - - - - - - A、依据色谱峰的个数,可以断样品中所含组份的最少数；B、依据色谱峰的保留值 或位置 ,可以进行定性分析；C、依据色谱峰下的面积或峰高,可以进行定量分析；D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度,评判色谱柱分别效能；E、色谱峰两峰间的距离,是评判固定相 色谱理论 两组份完全分别必需满意：A、两组份的安排系数必需有差异；和流淌相 挑选是否合适的依据；B、区域扩宽的速率应小于区域分别的速度；C、在保证快速分别的前提下,供应足够长的色谱柱；吸附平稳：色谱过程的热力学讨论,它是进展高挑选性柱的理论基础当吸附剂与溶液中的溶质达到平稳时,其吸附量q* 同溶液中溶质的平稳应与

11、温度有关；当温度肯定时,吸附量只和浓度有关,q* = fc - 吸附等温线；c 之间的关系为线性函数：A、 Henry type 亨利模型 在肯定温度下, 平稳时吸附剂吸附溶质浓度 * m 为安排系数；q mcq * 与液相溶质浓度适应条件：在低浓度范畴之内成立；当浓度较高时,上式无效；此外仍有佛罗因得利希模型,兰格谬尔模型,BET模型等塔板理论：色谱过程的动力学讨论,它是进展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础塔板理论-柱分别效能指标1、 色谱柱看成是由很多小塔板组成,流过每个塔板的两相瞬时达到平稳；2、 塔板数高度H,色谱柱长度L,理论塔板数的关系为：n=L/H; 3、 流淌相不行以压缩

12、；4、 全部样品在进样开头时都集中在第一块塔板上；5、 物质的安排系数不随其浓度变化6、 将载气看作成脉动（间歇）过程；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 7、 试样沿色谱柱方向的扩散可忽视；n 称为理论塔板数 theoretical plate number ；与精馏塔一样,色谱柱的柱效随理论塔板数 n的增加而增加,随塔板高 H 的增大而减小；n 与半峰宽及峰底的关系式为 : 式中 tr或 Y1/2应实行同一单位 时间或距离 ；上式示：在 t R肯定时,假如色谱峰越窄,就说明 n 越大, H 越小,柱效能越高；在实

13、际工作中,按上式运算出来的n 和 H 值有时并不能充分地反映色谱柱的分别效能,因为采纳 tR运算时,没有扣除死时间tM,所以,常用有效塔板数n 有效表示柱效：有效塔板高为：例 1 已知某组分峰的峰底宽为40S,保留时间为400S,运算此色谱柱的理论塔板数；塔板理论的特点和不足 :1 当色谱柱长度肯定时,塔板数n 越大 塔板高度H 越小 ,被测组分在柱内被安排的次数越多,柱效能就越高,所得色谱峰越窄；2 不同物质在同一色谱柱上的安排系数不同,能的指标时,应指明测定物质；用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效3 柱效不能表示被分别组分的实际分别成效,当两组分的安排系数 K 相同时,无论该色谱柱的塔

14、板数多大,都无法分别；4 塔板理论无法说明同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的试验结果,也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径；第八章 常见的生化分别色谱技术名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 凝胶过滤色谱：凝胶色谱是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相,依据流淌相中所含各种组份的分子大小不同而达到物质分别目的的一种色谱技术；凝胶色谱按流淌相类型分为两类：流淌相为有机溶剂时为凝胶渗透色谱；当流淌相为水溶液时,为凝胶过滤色谱；凝胶色谱的原理：含有不同分子大小组份的样品进入凝胶色谱柱时,大分子物质由于分子直径大,不能

15、进入凝胶的微孔内, 只能分布于凝胶颗粒的间隙中,以较快的速度流过凝胶柱；较小的分子就能进入凝胶的微孔内, 不断地进出于一个个颗粒的微孔内外,这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢；而分子大小介于二者之间的分子在流淌中部分渗透；这种在颗粒内部扩散的结果, 使小分子在柱内移动速度最慢,中等分子次之, 大分子移动速度最快,最先流出；样品依据分子大小的不同,按分子从大到小依次次序从色谱柱内流出；凝胶介质像分子筛一样,将大小不同的分子进行分别,因而凝胶色谱又叫体积排阻色谱；凝胶色谱的参数排阻极限： 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩 质量；散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子分级范畴 :能被凝胶阻

16、滞并且相互之间可以得到分别的溶质的相对分子质量范畴；500土溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸取的水分的百分数；Sephadex G50 的溶胀率为30；凝胶粒径： 凝胶一般为球形,其粒径大小对分别度有重要影响；粒径越小,HETP 越小,分离效率越高；床体积： 1g 干燥凝胶溶胀后所占有的体积；Sephadex G50的床体积为911cm3/g 干胶；间隙 外水 体积： 指色谱柱中凝胶之间间隙的体积,于排阻极限的溶质测定,一般使用平均相对分子质量为凝胶色谱的理论Vt=Vo+Vi+Vg= R 2h 即 V0 值；间隙体积可用相对分子质量大 2000 kD 的水溶性蓝色葡聚糖凝胶柱床总体积Vt 是凝胶外

17、水体积Vo,凝胶内水体积Vi和干凝胶颗粒体积Vg 之和洗脱体积： Ve=Vo+Kd*V i Kd为每个溶质分子在流淌相和固定相之间的一个特定的安排系数 Kd=0,溶质的分子体积大,完全不能进入凝胶颗粒微孔内,被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗 脱下来； Kd=1,说明这种溶质的分子体积小,完全在凝胶颗粒内部扩散,在洗脱过程中将最后流出；当0Kd1,表示离子交换剂对 B+的结合力大于 A+；【RB】【RA】如 K1,表示离子交换剂对 B +的结合力小于 A +；【RB】【RA】分类 ：阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,每种都可分强弱两种洗脱： 假如采纳离子强度不变的流淌相进行恒定洗脱,两种蛋白质的洗脱体

18、积相差很大,甚 至安排系数大的蛋白质很难洗脱；因此, IEC操作很少采纳恒定洗脱法,而多采纳线性梯度 洗脱法 P153linear gradient elution 、阶梯洗脱法 stepwise elution ；恒定洗脱法：洗脱体积大 ,溶质洗脱不尽 线性梯度西洗脱法：优点：流淌相 I/pH 连续变化,不易显现干扰峰,操作范畴广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备,如梯度混合器；阶梯洗脱法：优点：无须特殊设备,操作简洁；缺点： 流淌相浓度不断变化,易显现干扰峰,简洁显现多组分洗脱峰重叠的现 象；离子交换层析的操作：1、 装柱： 挑选合适的离子交换剂,经过预处理后,用合适的PH 的缓冲液（ pbs

19、）装柱,注名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 意不要让离子交换剂暴露空气2、 层析柱平稳： 用泵将至少2 倍柱体积的缓冲液过柱；这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平稳与均一,以利于后续目的蛋白的结合,留意点：缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍；平稳缓冲液的流速可略高于正常操作流速；平稳终点以流出液的离子浓度、导电性、 pH 值与缓冲液一样为准,其中 pH 值最重要3、 样品进柱： 将目的样品试剂加到交换柱上,经过一段时间之后,蛋白质将通过离子交换的方式,与介质相互作用而挂柱；并开头记录某吸光度下吸取值的变化（蛋白质

20、为：280nm） ,留意点 :为了达到中意的分别成效,进样量一般为介质交换容量的 10-20% 为了防止进样溶液中的离子强度过高,样品浓度不宜太高4、 冲平： 用缓冲液洗涤离子交换柱无穿透峰为止,并在吸取峰下降段取样5、 洗脱： 用含与交换剂亲和力更大的离子的缓冲液进行梯度洗脱,并收集洗脱峰处的样品6、 再生： 用大量水洗 4 倍柱体积,等再生处理措施7、 储存： 用泵将 2 倍体积的 20%乙醇过柱,介质回收用于蛋白质分别纯化的介质多储存于液体中,储存时需加入一些抑菌剂等,有些只要采纳 20%乙醇储存即可离子交换层析的蛋白质操作留意事项：1、 由于蛋白质是两性电解质,在不同的pH 值下,其解

21、离程度是不同的,因此既可以采纳阳离子交换,也可以用阴离子交换,可视详细情形而定 2、 由于蛋白质的极性基团很多,为了防止洗脱困难,通常采纳弱阳或弱阴离子交换剂3、 适当调剂缓冲溶液的pH 值,使蛋白质适当解离,通常采纳的pH 值靠近其等电点 （不是等电点）其他留意事项：留意各种厂家供应柱材料的pH 范畴；留意流速范畴 （压力范畴） ,以免损坏胶颗粒；留意装柱（匀称,无气泡）,保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）；预备样品使其处于与平稳缓冲液相同的pH 及离子强度的环境之中,留意样品的溶解性,不要有沉淀产生及颗粒物质 ;样品中应当防止含有去污剂及离液剂样品总量不应超过柱的结合容量 在位清洗,上样体

22、积一般无特殊的限制；在位清洗（除去柱床的沉淀蛋白和顽固蛋白）除脂类,疏水蛋白的方法：使用递增式梯度以 4 10CV70%乙醇或 30%异丙醇洗柱, 再用至少3CV蒸馏水过柱； 或以 0.5%非离子性去污剂（溶于1mol/L 乙酸中）洗柱,再用5CV70%乙醇过柱,最终用4 10CV蒸馏水加以清洗；在位消毒在位消毒（将微生物感染降到最低）方法： 用 0.51mol/L 氢氧化钠以该凝胶的建议流速洗柱,约 0.51h 然后以最少3CV平稳缓冲液过柱离子交换层析特点：优点： 处理量大,浓缩,高速；挑选高,所需柱长较短；回收率高；离子交换剂种类多,价格也远低于亲和吸附剂缺点 ：IEC的操作变量远多于G

23、FC,影响分别特性的因素特别复杂名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 疏水色谱（疏水性相互作用层析）疏水性相互作用层析的原理疏水性相互作用层析Hydrophobic interaction chromatography,HIC是利用表面偶联弱疏水性基团 疏水性配基 的疏水性吸附剂为固定相,依据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分别纯化的洗脱层析法；亲水性蛋白质表面均含有肯定量的疏水性基团,疏水性氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸等含量较多的蛋白质疏水性基团多,疏水性也大； 尽管在水溶液中蛋白

24、质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用,但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面；这部分疏水基团可与固定相表面弱疏水基发生疏水性相互作用,被固定相 疏水性吸附剂 所吸附；疏水层析的操作柱子和填料预备样品制备样品上样洗脱洗涤和在平稳分析结果吸附生物大分子采纳柱层析法,装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同；为了使要分别的生物大分子能紧密结合在柱上,挑选适当的缓冲液、pH 和离子强度,也要考虑温度因素；为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子,可以用以下的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；减弱洗脱剂的极性,也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的

25、洗脱剂每次试验终止后,吸附剂需要再生；由于吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等；未经再生的疏水吸附剂,其吸附容量将明显降低；一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤,装柱,用初始缓冲液平稳吸附剂；吸附剂经再生后可反复使用；蛋白质的纯化过程中,各种分别技术结合的次序是很重要的；疏水层析可用在沉淀步骤之后,或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用；疏水性相互作用层析的应用及特点1st互补工具： HIC主要用于蛋白质类分别纯化,虽然HIC不如 IEC的应用广泛,但可以作为 IEC的互补工具；如方法得当,HIC与 IEC的分别效率相当；2nd 与盐析连接： 由于在高浓度盐溶液中疏水

26、性较大,因此 HIC可直接分别盐析后的蛋白质溶液；3rd 可以通过调剂疏水性配基链长和密度来掌握吸附性能的大小,质挑选适当的吸附剂；4th 疏水性吸附的种类多,挑选余地大,价格与离子交换剂相当；反相层析反相层析定义和原理：因此可依据目标产物的性名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - Reversedphase chromatography ,RPC是利用非极性的反相介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流淌相,依据溶质极性疏水性 的差别进行溶质分别纯化的洗脱层析法；与前述 HIC 同样, RPC中溶质也通过疏水性相互作用

27、安排于固定相表面,但是 RPC固定相表面完全被非极性基团所掩盖,表现猛烈的疏水性；因此,醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分别；必需采纳极性有机溶剂（如甲RPC主要用于相对分子质量低于 5000,特殊是 1000 以下的非极性小分子物质的分析和纯化, 也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化；由于反相介质表面为猛烈疏水性,并且流淌相为低极性有机溶剂,生物活性大分子在RPC分别过程中简洁变性失活；所以,以回收生物活性蛋白质为目的时,应留意选用相宜的反相介质；溶质在反相介质上的安排系数取决于溶质的疏水性,一般疏水性越大,安排系数越大；与其它层析法一样,当固定相肯定时,可通过调剂流淌相的组成调整溶质

28、的安排系数；流淌相的极性越大,溶质的安排系数越大；因此RPC多采纳降低流淌相极性水含量 的线性梯度洗脱法；反相介质 反相介质的商品种类繁多,其中最具代表性的是以硅胶为载体,通过硅烷化反应在硅 胶表面缝合非极性分子层制备；除硅胶外,高分子聚合物也可作为反相介质的载体,如 TSK gel Octodecyl4PW 和 TSK gel OctadecylNPR聚丙烯酸酯 C18等；反相层析的特点反相介质性能稳固,分别效率高,可分别蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质；因此,RPC做为定量分析手段,广泛应用于科学讨论、 临床诊断、工业检测和环境爱护等各个行业；

29、做为产品纯化制备手段,由于反相介质与其分别的对象相比价格较高,多限于试验室规模的应用,在大规模工业生产中应用较少；反相色谱与疏水色谱的不同在哪几方面：1、 疏水配机的密度不同2、 流淌相体系不同,PRC流淌相一般为有机溶剂（如甲醇、乙醇） ,而 HIC流淌相就为水溶液3、 再生条件不同；PRC再生在猛烈条件下,如采纳极性小的有机溶剂,使得蛋白质溶液易变性,因此 RPC主要用于小分子肽或蛋白质,而疏水色谱主要针对大分子,采纳降低盐浓度等方法进行再生,条件比较温顺；疏水色谱主要用于分别含有疏水基团较多的蛋白质亲和层析：生物分子能够区分结构和性质特别接近的其他分子,挑选性地与其中某一种分子相结合；生

30、物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用；利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分别纯化的技术称为亲和分别技术亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分别纯化的液相层析法名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 亲和层析原理 亲和作用机理,特殊是蛋白质亲和作用机理尚不清晰蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构,上述结构恰好能使某些小分子进入到其中,形成构象上的钥匙-锁关系 亲和作用不仅依靠结构上相像性,仍需要多种力的相互作用亲和作用中的相互作用力：静电作用 氢键 疏水性相互

31、作用配位键 弱共价键影响亲和作用的因素：离子强度 pH 抑制氢键形成的物质温度 螯合剂 亲和层析的操作及影响因素过程：进料清洗洗脱柱子再生；应保证配基对目标产物有较高的吸附容量；目标产物在亲和介质上的吸附平稳多用 进料过程中的杂质影响Freundlich 或 Langmuir 型的等温式表示；料液中目标产物浓度很低,杂质很多,少量杂质的非特异性吸附,会大大降低纯化成效；杂 质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关；进料的料液流速 流速的增大,分别速度加快,但柱效降低；目标产物洗脱 特异性洗脱名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页,共 21 页精选学

32、习资料 - - - - - - - - - 洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物非特异性洗脱：调剂洗脱液的 常见亲和色谱：pH 值,离子强度,离子种类或温度等理化性质；免疫亲和色谱：利用 抗体 作为配基的亲和色谱；色素亲和色谱：利用 色素 作为配基的亲和色谱；t-PA的纯化 -酶的抑制剂为配基固定化金属离子亲和层析相关概念和参数：配基（ ligand：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子；亲和层析配体类型：酶的抑制剂 : 大豆胰蛋白酶抑制剂抗体：抗体 -抗原, Ka=10 7-10 12；单抗免疫亲和层析A 蛋白：与免疫球蛋白 IgG 结合；凝集素：与糖特异性结合的蛋

33、白；伴刀豆球蛋白；辅酶和磷酸腺苷：辅酶 I,与脱氢酶,激酶结合；三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料；过渡金属离子 :Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸 : 咪唑环,静电和疏水作用；Reactive Blue 2 与脱氢酶,激酶结合；肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质；,与脂蛋白,脂肪酶抗凝血酶等结合；特异性 亲和体系高特异性 酶-底物、产物、抑制剂抗原 -单克隆抗体 荷尔蒙 -受体蛋白 核酸 -互补碱基链段 群特异性 免疫球蛋白 -A 蛋白、 G 蛋白酶-辅酶 酶、蛋白质 -过渡金属离子（Cu 2+,Zn 2+ 凝集素 -糖、糖蛋白、细胞表面受体 间隔臂的作用：当配基分子量较小时,

34、为了排除空间位阻作用, 需要在配基和载体之间连 接一个 “间隔臂 ” 间隔臂的长度有肯定限制, 超过肯定长度后, 配基与目标分子的亲和力会 减弱 层析的操作（一）凝胶的挑选与处理名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1.凝胶及柱的挑选 依据样品的分子量挑选合适的凝胶及层析柱；2.凝胶的处理凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10 倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去；自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐步升温至近沸,1-2 小时即可达到凝胶的充分胀溶；加热法既可节约时

35、间又可消毒；（二）装柱1.装柱前,必需用真空干燥器抽尽凝胶中空气,并将凝胶上面过多的溶液倾出；2.先关闭层析柱出水口,向柱管内加入约1/3 柱容积的洗脱液,然后边搅拌,边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中,使其自然沉降, 等凝胶沉降约2-3cm 后,打开柱的出口, 调剂合适的流速,使凝胶连续沉集,待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 水口；（三）凝胶柱的平稳5cm 处时停止装柱,关闭出通过 2-3 倍柱床容积的洗脱液使柱床稳固,然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布,以防将来在加样时凝胶被冲起,并始终爱护凝胶上端有一段液体；（四）加样1.预备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪2.打开柱上端的螺丝帽塞子,吸

36、出层析柱中余外液体直至与胶面相切；沿管壁将细胞色素 C样品溶液 1 mL 当心加到凝胶床面上,应防止将床面凝胶冲起,打开下口夹子,使样品溶液流入柱内,同时收集流出液,当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子；按加样操作,用 1 mL 洗脱液冲洗管壁2 次；最终加入34 mL 洗脱液于凝胶上,旋紧上口螺丝帽,柱进水口连通恒压瓶, 柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连,部分收集器相连；（五）洗脱比色池出液口再与自动洗脱时,打开上、下进出口夹子,用 0.02mol/LTris-HCl,以每管 3 mL/10 min 流速洗脱,用自动部分收集器收集流出液；（六）收集各洗脱峰留意事项：1）各接头不

37、能漏气,连接用的小乳胶管不要有破旧,否就造成漏气、漏液；2）装柱要匀称,既不过松,也不过紧,最好在要求的操作压下装柱,流速不宜过快,防止 因此压紧凝胶；3）始终保持柱内液面高于凝胶表面,否就水分蒸发,凝胶变干；也要防止液体流干,使凝 胶混入大量气泡,影响液体在柱内的流淌；主要色谱的比较：（P122）名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 下游操作的三个阶段：名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页,共 21 页精选学习资料 - - - - - - - - - 亲和分别技术亲和安排利用偶联亲和配基的 PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取,可在配基的亲和作用 下促进目标产物在 PEG相的安排,提高目标产物的安排系数和挑选性；这就是亲和萃取,又称亲和安排