习题核酸分子杂交技术.doc

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1、第二章 核酸杂交技术一名词解释 1原位杂交2核酸分子杂交技术3探针 4反向点杂交5缺口平移标记法6随机引物标记法7末端标记法8Southern blot杂交9荧光原位杂交10菌落杂交二选择题【A型题 】1DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的 A GC含量B AT含量C AG含量D AC含量E TG含量2液相杂交是以下哪一种 A Southem印迹杂交B Northem印迹杂交C Dot印迹杂交D Slot印迹杂交E RPA实验3研究得最早的核酸分子杂交种类是 A 菌落杂交B Southern杂交C Northern杂交D 液相杂交E 原位杂交4Southern杂交通常是指 A DNA与RNA杂

2、交B DNA与DNA杂交C RNA与RNA杂交D 蛋白质与蛋白质杂交E DNA与蛋白质杂交5最容易降解的核酸探针是( )A cDNA探针B dsDNA探针C ssDNA探针D gDNA探针E: RNA6探针基因芯片技术的本质就是 A 核酸分子杂交技术B 蛋白质分子杂交技术C 聚合酶链反响技术D 基因重组技术E 酶切技术7DNA探针的长度通常为( )A 1000 2000个碱基B 500 1000个碱基C 400 500个碱基D 100 400个碱基E. 100个碱基8寡核苷酸探针的最大的优势是 A 杂化分子稳定B 可以区分仅仅一个碱基差异的靶序列C 易标记D 易合成E 易分解9在Souther

3、n印迹中常用的核酸变性剂是( )A 甲醛B 乙醛C 氢氧化钠D 碳酸钠E 盐酸10盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是 A 脆性大B 本底低C 共价键结合D 非共价键结合E 高结合力11最常用的DNA探针标记方法是( )A 随机引物 B 切口平移C 3 -末端标记 D 5 -末端标记E PCR法12为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生 A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经枯燥过B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过135一末端的D

4、NA探针标记主要依靠的酶是( )A T4多聚核苷酸激酶B 末端转移酶C AKP D DNA polE DNA pol14血友病是一种 A 染色体病B X连锁遗传病C 先天性代谢缺陷病D 先天畸形E 常染色体隠性遗传病15预杂交中最常用的封闭剂是( )A Denhavdts溶液 B 5TBE C 1TBE D 1TAE E 1TPE16检测目标是RNA的技术是 A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交淋巴瘤17检测靶序列是DNA的技术是 A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交

5、淋巴瘤18DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称 A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针19具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称 A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针20一种标记核酸与另一种核酸单链进展配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称 A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针21点/狭缝杂交可以用于 A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测22放射自显影时反射光产生的潜影 在低温下较稳

6、定，最适温度是( )A -70 B -30C -20 D -10E 423Southern印迹杂交可以用于 A 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测24寡核苷酸探针的Tm简单计算公式为( )A Tm=4(G+C)+2(A+T)B Tm=2(G+C)+4(A+T)C Tm=6(G+C)+4(A+T)D Tm=2(G+C)+6(A+T)E Tm=6(G+C)+2(A+T)25Northern印迹杂交可以用于 A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品

7、中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 检测的目标是RNAD 用于基因定位分析E 阳性菌落的筛选2626荧光原位杂交可以用于 A 快速确定是否存在目的基因B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测27以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，假设能与突变探针及正常探针接合，那么该样本为 A 正常人B 杂合体患者C 纯合体患者D 携带者E 不能确定28在pH为下述何种范围时，Tm值变化不明显( ) A pH为35 B pH为45C pH为56 D pH为59E pH为81129一般来说，设计的寡核苷酸探

8、针的长度为 A 2-10bpB 17-50bpC 60-100bpD 100-200bpE 200-300bp30变性剂可使核酸的Tm值降低，常用的变性剂是( )A 甲酰胺 B 氢氧化钠C 浓盐酸 D 稀盐酸E 甲醇31以下有关cDNA探针的描述不正确的为 A 利用mRNA通过RT-PCR在体外反转录可制备大量的cDNA探针B cDNA探针不包含内含子C cDNA探针不包含大量的高度重复序列D 由于cDNA探针自身所携带的polydT，有可能产生非特异性杂交的问题E cDNA探针合成方便，成为探针的重要来源32一般来说核酸杂交的温度低于其Tm值的多少度进展( )A 1525 B 1015C 5

9、10 D 3040E 405033对于寡核苷酸探针，杂交温度一般般低于其Tm值( )A 3040 B 2030C 1530 D 1015E 534一般情况下，不含变性剂甲酰胺时，杂交反响常在多少下进展( )A 90 B 80C 75 D 68E 5835在含50%甲酰胺时，杂交反响在多少进展( )A 70 B 65C 55 D 42E 3536杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加1%，那么Tm值下降( )A B 1C 2 D 33. SE 4 37RNA/RNA的杂交体的Tm值一般应增加( )A 15 B 510C 1015 D 1520E 202538杂交的时间一般为Cot1/2的( )A

10、 l倍 B 13倍C 3 5倍 D 58倍E 10倍以上39为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中参加( )A ssDNA B 1SSCC 10SSC D 5TBEC E 50TAE40随机引物法标记探针常用的A、G、C、T聚合体的数目是( )A 4个 B 6个C 8个 D 10个E 12个 【X型题】41以下哪些是影响DNA复性的因素( )A DNA浓度 B DNA的分子量C 温度 D 碱基组成E DNA的来源42 DNA探针的优点有 A 制备方法简单B DNA探针易降解C DNA探针的标记方法成熟，有多种方法可以选择D 克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽E 单链，不存在竞争性的自身复

11、性43以下哪些方法可以用于探针的全程标记 A DNA加尾法B DNA切口平移标记法C 随机引物标记法D 末端标记E 尾端标记44关于DNA变性的描述正确的选项是( )A 二级构造破B 一级构造破坏C 黏度降低D 生物活性丧失E 浮力密度增加45以下哪些因素可以使DNA变性 A 增加溶液的浓度B 加热C 改变溶液的pH值D 有机溶剂E 冷藏46预杂交中，以下能起封闭作用的是( )A ssDNA B BSA C 小牛胸腺DNA D 脱脂奶粉E DTT47变性的DNA会发生哪些理化性质的变化 A 粘度下降B 沉降速度增加C 浮力下降D 紫外光吸收增加E 紫外光吸收减少48.以下物质适于非放射性探针标

12、记的是( )A AKP B ACP C 生物素 D 地高辛E 荧光素49关于人工合成的寡核苷酸探针，以下描述正确的选项是( )A 特异性高 B 可依赖氨基酸序列推测其序列 C 分子量小 D 可用于相似基因顺序差异性分析 E 可用末端转移酶进展5端标记50通过哪些措施可以提高杂交反响的速度 A 采用大片段探针B 少量的反响体积C 高反响温度D 不断的振摇E 大量的反响体积51关于切口平移法下述正确的选项是( )A 可标记线性DNA B 可标记松散螺旋DNA C 可标记超螺旋DNA D 可标记存在缺口的双链DNA E 可标记随机引物52以下哪些方法可以用于从凝胶上转移DNA A 毛细转移B 真空转

13、移C 负压转移D 电泳转移E 冷冻转移53关于随机引物法标记探针下述正确的选项是( )A 可标记单链DNAB 可标记双链RNA C 可标记单链RNA D 比活性高达108cpmg DNA以上 E 常经过SephadexG-50纯化才可使用54可以采用哪些方法来标记探针 A 杂交标记法B 切口平移标记法C 5-末端的标记D 3-末端的标记E 化学法延长标记55整个杂交反响主要以下哪些步骤组成 A 预杂交B 杂交C 洗脱D 固定E 转移56放射自显影可以被分为 A 直接放射自显影B 氧化显影C 封闭显影D 间接放射自显影E 固定显影57关于电转移以下描述正确的选项是( )A 快速、高效 B 需要特

14、殊设备 C 缓冲液用TAE或TBE D 可产生高温 E 常用NC膜作为支持介质58预杂交的主要目的是 A 平衡滤膜B 封闭非特异性杂交的位置C 提高杂交信号的检测效率D 便于从滤膜上除去探针E 去除用于杂交反响检测的显色物质59.关于非放射性探针标记，以下描述正确的选项是( )A 对人体危害小 B 需要特殊设备 C 可长时间使用 D 灵敏度不如放射性探针 E 重新杂交新探比拟容易60对于改变DNA片段长度的突变，可以由于缺失或插入产生，或由于限制性酶切位点改变而导致限制性片段长度改变。可以通过哪些方法检测 A PCR扩增B RAPDC Southerm印迹杂交D Northern印迹杂交E 以

15、上都不是61重组DNA的筛选可用核酸分子杂交的方法，常用于检测DNA的杂交方法有哪些 A 菌落印迹杂交B Northern印迹杂交 C Western印迹杂交D 原位杂交 E 斑点杂交62关于RNA探针的描述以下正确的选项是( )A 可用于随机引物标记 B 特异性高 C 灵敏度高 D 可用非同位素标记法标记 E 不易降解63以下哪些可以作为核酸探针使用 A microRNAB 单链DNAC 寡核苷酸D mRNAE 双链RNA64关于核酸探针的描述以下正确的选项是( )A 可以是DNA B 可以是RNA C 可用放射性标记 D 可用非放射性标记 E 必须是单链核酸三问答题1根据哪三种不同的分类标

16、准可以将杂交分为哪几类？2简述反义核酸技术的根本原理及其应用范围3试述Northern blot杂交的操作步骤？4什么是肽核酸？并简述其应用？5请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用。6请表达杂交探针标记方法的种类。7简述直接放射自显影的原理。参考答案（一） 名词解释1原位杂交：是首先应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基互补配对原那么进展特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进展细胞内基因定位或基因表达的检测技术。2核酸分子杂交技术：单链的核酸分子在适宜的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交。利用核酸分子杂交检测靶序列

17、的一类技术称核酸分子杂交技术。3探针：是一段单链或双链核苷酸，用放射性核素或非放射性物质标记其末端或全链，可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进展杂交，以探测它们的同源程度。这一段标记的核苷酸被称为探针。4反向点杂交：是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。5缺口平移标记法：该法是利用低浓度DNase I在DNA双链上随机切开假设干个切口，然后利用E. coli DNA聚合酶I的53外切酶活性与5 3聚合酶活性，使DNA链上的核苷酸不断被切除，而带放射性核素标记的dNTP不断地被填入缺口

18、位置，从而形成两条链被均匀标记的高放射活性的探针。6随机引物标记法：随机引物是各种可能序列的寡核苷酸混合物，可以人工合成，也可以使用小牛胸腺DNA的DNase I降解物。随机引物在较低的退火温度下，能与各种单链DNA模板结合。首先使双链DNA分子变性成为单链，然后退火使随机引物结合于两条单链模板上，当反响液中存在的4种dNTP中有一种带放射性核素标记时，在DNA聚合酶催化下合成新的带标记的DNA链。反响完毕后经纯化即可得到标记的DNA探针。7末端标记法：寡核苷酸探针由于较其他类型的探针短，需要采用末端标记法。该法需要DNA分子的末端带有羟基，而人工合成寡核苷酸的5端本身即为羟基。其原理是利用多

19、核苷酸激酶将g-32P ATP分子上7位磷酸基转移至寡核苷酸链的5末端，末端标记也可在3端进展。8Southern blot杂交：是研究DNA图谱的根本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的方法是将标本DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖电泳别离各酶切片段，接着，使酶切片段DNA发生变性并转印到一固相支持物 (通常是硝酸纤维素薄膜或尼龙膜)上，经固定后与标记探针进展杂交。这种方法不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息。9荧光原位杂交：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进展检测

20、的技术。它将荧光信号的高灵敏度、平安性，荧光信号的直观性与原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进展原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进展区分与计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进展检测与诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前与预后提供准确的依据。10菌落杂交：用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称菌落杂交，主要步骤包括：菌落平板培养；滤膜灭菌后放到细菌平板上，是菌落粘附到经适当饱与的吸水纸上；菌斑溶解产生单练的DNA、固定DNA，用32P标记的探针与菌落进展杂交；杂交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于X线胶片进展放射自显影；将自显影胶片、滤膜、培养平板相比

21、拟，就可以确定阳性菌落。二选择题【A型题】1A 2E 3D 4B 5E 6A 7C 8B 9C 10B 11A 12A 13A 14B 15A 16C 17A 18A 19B 20D 21A 22A 23A 24A 25C 26C 27D 28D 29B 30A 31E 32A 33E 34D 35D 36B 37E 38B 39A 40. B【X型题】41ABCD42ACD43BC44ACDE45BCD46ABCD47ABD48ACDE49ABCD50BCD51ABCD52ABD53ABCD54BCD55ABC56AD57ABCD58AB59ABCD60AC61ADE62ABCD63BCD6

22、4ABCD三问答题1根据哪三种不同的分类标准可以将杂交分为哪几类？根据杂交核酸分子的种类，可以分为DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂交，RNA与RNA杂交；根据杂交探针标记的不同，可以分为同位素杂交与非同位素杂交；根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交与原位杂交；其中固相杂交又可以分为菌落杂交、Southern杂交、Northern杂交、点杂交与狭缝杂交。2简述反义核酸技术的根本原理及其应用范围反义核酸技术是近几年开展起来的一项新的生物技术。它是根据碱基互补的原理，设计出能特异地同相应靶基因结合的RNA或DNA，从而影响靶基因的转录与翻译，以到达调控靶基因表达的目的。反义核酸技术包括

23、反义RNA技术，反义DNA技术及核酶技术。3试述Northern blot杂交的操作步骤？RNA的变性琼脂糖电泳；将硝酸纤维薄膜放在含有RNA电泳条带的凝胶上；转印盘中的转移缓冲液将逐渐为胶与膜上覆盖的吸水纸吸收，从而利用毛细作用将胶中的变性RNA分子转移到硝酸纤维薄膜上；转印完成后，使RNA分子固定到膜上；膜上的RNA分子与探针杂交；经放射自显影或其他检测技术显示出杂交区带。4什么是肽核酸？并简述其应用？肽核酸是一种全新的DNA类似物，在20世纪90年代由丹麦科学家创造。肽核酸中以中性的肽链酰胺2-氨基乙基苷氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键，其余构造与DNA相似。PNA可以通过碱基互补配

24、对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋构造。由于PNA不带电荷，与DNA与RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性与特异性都大为提高；PNA与DNA或RNA的杂交能力远远优于DNA、DNA或DNA、RNA杂交，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异性，而且不被蛋白酶与核酸酶水解等方面。鉴于上述诸多优点，近年来，PNA被广泛应用在许多高科技领域。如：病原体、遗传病的检测，抗癌、抗病毒反义核酸的研究与应用。特别是PNA可取代核酸用于基因芯片的制备，被认为是基因芯片的升级产品。PNA还可用于定量PCR分析。随着对PNA研究的不断深入，PNA将显示出更大的优越性与更为广阔的应用前景。5请

25、举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用在临床检验科，杂交技术最常用于基因诊断的例子是镰状细胞贫血病的基因诊断。镰状细胞贫血是一种单基因遗传性疾病，病因是编码血红蛋白的基因发生点突变导致编码b链第6位的谷氨酸被缬氨酸取代，表示为b6(A 3)谷缬。在血红蛋白基因的碱基序列上表现为第6位密码子GAA突变为GTA，也就是在这一位点发生了A到T的点突变。由于这一突变导致基因内部一个MstII限制性酶切位点丧失，因而针对这一情况，可以设计与b-珠蛋白基因杂交的核酸探针。先扩增靶片断，并用MstII消化扩增的DNA片断，电泳别离消化的DNA片断。将DNA片断转印到硝酸纤维素薄膜上，采用Southe

26、rn杂交技术检测DNA片断。以此将正常人、携带者与患者区分开来。此外, 还可以用凝血因子基因探针检测B型血友病，凝血因子基因探针检测A型血友病，用胰岛素基因探针检测糖尿病，用苯丙氨酸羟化酶基因探针检测苯丙酮尿症。以上都是杂交技术在临床检验科进展基因诊断的例子。6请表达杂交探针标记方法的种类探针的标记方法可分为放射性核素标记法与非放射性核素标记法两大类。(1) 放射性核素标记的探针，灵敏度高、特异性强，主要缺点是容易造成放射性污染，而且放射性核素的半衰期较短，必须随用随标。标记手段主要有：缺口平移法、随机引物合成法与末端标记法。(2)非放射性核素标记法：非放射性核素标记法无放射性污染，探针标记后

27、可保存较长时间(2年以上)，但灵敏度与特异性尚不如核素标记。常用的标记物有生物素、地高辛配基与辣根过氧化物酶。标记手段类似于放射性核素标记。生物素标记探针：生物素(biotin)是一种水溶性维生素，可与dUTP的C5位共价结合，用其标记的dUTP可代替dTTP掺入DNA探针。这种标记探针能与抗生物素蛋白(avidin)特异结合，而抗生物素蛋白上结合的碱性磷酸酶可使反响中的底物显色，从而指示出探针所在位置。地高辛配基标记探针：地高辛配基(digoxigenin)可与dUTP共价结合，用其标记的dUTP也可代替dTTP掺入DNA探针，可用与酶或荧光色素结合的抗地高辛配基抗体直接检测，或间接使用免疫

28、荧光法进展检测。辣根过氧化物酶标记探针：首先将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)与带正电荷的聚乙烯亚胺(polyethylene imine)交联结合，然后由这种带正电荷的复合物与带负电荷的单链或双链DNA结合，在戊二醛稀溶液作用下，HRP与DNA形成共价键，产生酶标记探针。杂交后利用酶促反响使底物显色即可指示探针位置。该法是利用化学反响直接将酶连接在核酸上，而不需要将酶先连接于dNTP再掺入DNA分子，因此更为简便。7简述直接放射自显影的原理直接放射自显影是在暗室巾将含放射性杂化分子的滤膜与X胶片严密的贴在一起，放入不透光的盒子，同位素衰减会释放射线感光胶片上的银颗粒，产生稳定的潜影，胶片经冲洗后产生可见的图像。图像的位置与胶片上杂化分子的位置一致，图像的深浅反响了杂化分子的含量。X线胶片常常为弹性塑料片，在其两面均覆盖了照相感光乳胶与白明胶，白明胶覆盖在照相感光乳胶的外层以防止其被刮脱。32P、35S、14C元素放射的射线会穿透X线胶片，少局部作用于X线胶片的照相感光乳胶。第 21 页