实验五、多抗制备4+免疫比浊.ppt

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1、实验五、多抗制备4+免疫比浊 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望本次实验内容实验一、双向免疫扩散试验实验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗鉴定及效价测定多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定实验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测 一、本次实验的目的：1、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。2、掌握双向免疫扩散试验方法。3、掌握抗体效价的判断。4、掌握免疫浊度的测定原理。5、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。沉淀反应（precipitation

2、）可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在适与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现当条件下发生特异性结合所出现的的沉淀现象沉淀现象。分类分类液体内沉淀试验液体内沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定免疫浊度测定凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫扩散免疫电泳免疫电泳单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳沉沉淀淀反反应应思考：抗原抗体反应的四大特点？特异性特异性 可逆性可逆性比例性比例性 阶段性阶段性沉淀反应的特点抗原为抗原为可溶性可溶性物质，如蛋白质、多糖物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶

3、段：沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见不可见)第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）条件条件 电解质，温度，酸碱度电解质，温度，酸碱度 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指主要是指琼脂糖扩散琼脂糖扩散或称或称凝胶凝胶扩散扩散(gel diffusion)(gel diffusion)。常用的凝胶。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为验

4、分为2类：类：（一）免疫扩散（一）免疫扩散 单向单向免疫扩散试验免疫扩散试验 (single gel diffusion test)双向双向免疫扩散试验免疫扩散试验 (double gel diffusion test)（二）凝胶免疫（二）凝胶免疫电泳电泳(gel immuno-electrophoresis)火箭免疫电泳火箭免疫电泳双扩散免疫电泳双扩散免疫电泳一、单向免疫扩散试验(一一)原理原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗

5、原浓度呈正相关。小与抗原浓度呈正相关。(二)操作步骤（平板法）1.1.将将抗体抗体和和0.9%0.9%琼脂糖琼脂糖50-5650-56混合混合,即刻即刻倾注成平板。倾注成平板。2.2.待凝固后在琼脂板上打孔待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入孔中加入已已稀释的抗原溶液稀释的抗原溶液和不同浓度的和不同浓度的抗原标准抗原标准品溶液品溶液。3.3.置置37,37,让其向四周自由扩散让其向四周自由扩散,24-48h,24-48h后后可见其孔周围出现沉淀环。可见其孔周围出现沉淀环。单向辐射状免疫扩散单向辐射状免疫扩散上排为上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右下排

6、右2为一异常病理血清为一异常病理血清(三)方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为性和线性均好。敏感度为1.25mg/L(四)影响因素1.抗原分子量抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。否则可能

7、出现结果偏高或偏低。2.抗体种类抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为，马抗血清为110IU/ml，羊为，羊为0.44IU/ml，为提高实验，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。敏感度，应首选敏感度高的抗血清。3.抗体稀释度抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也大，常造

8、成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度大稀释度以提高敏感度。二、双向琼脂扩散试验(一一)原理原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩浓度、纯度和扩散速率散速率等有关。等有关。(二)操作步骤（平板法）（平板法）1.融化琼脂，浇板融化琼脂

9、，浇板 每张载玻片约每张载玻片约4ml。2.凝固，打孔凝固，打孔 孔径孔径3mm，孔间距，孔间距35mm，孔，孔型有型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。型。3.加样加样 在相对孔内加抗原或抗体。在相对孔内加抗原或抗体。4.孵育孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。纯度、浓度和扩散速度有关。(三)双向免疫扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体及其相

10、对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中成对孔中根据沉淀线有无根据沉淀线有无定性定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量相对含量根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。相对扩散速率。沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；C：Ag、Ab浓度近似

11、，扩散率浓度近似，扩散率Ag Ab；D：扩散率近似，浓度：扩散率近似，浓度Ag Ab；E：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab；F：浓度：浓度Ag Ab，扩散率，扩散率Ag Ab2.抗原性质分析 利用利用三角孔型三角孔型，将待检抗原和标准抗原，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图据沉淀线形状分析待测抗原，见图。三种扩散基本图型三种扩散基本图型3.抗体效价滴定抗体效价滴定 用用梅花型梅花型孔，中间放孔，中间放抗原，周围孔放下不抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高以出

12、现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的稀释倍数为该抗体的效价。效价。效价检测结果效价检测结果该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中可以看免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中可以看出最后测得的效价分别为：出最后测得的效价分别为：1 1：256256，1 1：128128，1 1：128128中中中中间间孔孔孔孔抗原；抗原；抗原；抗原；周周周周围围孔孔孔孔血血血血清清清清血血血血清清清清的稀的稀的稀的稀释释倍倍倍倍数数数数分分分分别为别为：

13、孔孔孔孔11/811/811/811/8；孔孔孔孔21/1621/1621/1621/16；孔孔孔孔31/3231/3231/3231/32；孔孔孔孔41/6441/6441/6441/64；孔孔孔孔51/12851/12851/12851/128；孔孔孔孔61/25661/25661/25661/2566543214.抗体或抗原纯度鉴定抗体或抗原纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。双扩散试验优缺点优点：简单易行，用途广泛优点：简单易行，用途广泛缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。能精确定量。

14、经典的沉淀试验有经典的沉淀试验有4个缺点无法克服：个缺点无法克服：操作繁琐操作繁琐敏感度低（敏感度低（10100g/ml）时间长时间长难以自动化难以自动化免疫浊度测定（一）基本原理：免疫浊度测定的基本原理是：抗原免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。复合物，使反应液出现浊度。当当反应液反应液中保持中保持抗体过量且固定抗体过量且固定时，形成的时，形成的复合复合物随抗原量增加而增加物随抗原量增加而增加，反应液的，反应液的浊度浊度亦亦随之随之增加增加，与一系列的标准品对照，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含

15、量。即可计算出受检物的含量。（二）类型1.透射免疫比浊法2.散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法 1 透射免疫比浊法原理：原理：抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的合物粒子对光线的反射和吸收反射和吸收，引起透射光减，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物吸光度和复合物的量成正比的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量，当抗体量固定时，与待检抗原量成正

16、比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。待检抗原含量。方法评价：优点：优点：灵敏度比单扩法高灵敏度比单扩法高510倍；倍；CV小于小于10；操作简便快速，操作简便快速，1h可报可报告结果；告结果；结果准确，且能用全自结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。其应用更加广泛。缺点：缺点：抗体用量较大；抗体用量较大；检测需抗原抗体反应检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；达到平衡，耗时较长；不

17、宜用于药物等半抗不宜用于药物等半抗原的测定；原的测定；灵敏度较散射比浊法灵敏度较散射比浊法低。低。2 散射免疫比浊法原理：原理：散射光散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度散射光的强度与复合物的含量呈正比，与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形即待测抗原越多

18、，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速速率散射比浊法率散射比浊法(rate nephelometry)(rate nephelometry)和和终点散射终点散射比浊法比浊法(endpoint nephelometry)(endpoint nephelometry)。3 免疫胶乳比浊法原理原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，之内，光线可透过，

19、当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。凝集成正比，与抗原量成正比。（a a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b b）结合后，则形成光线衰减）结合后，则形成光线衰减方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液敏感度高，试剂稳定，因反应液中无中无PEGPEG沉淀剂的影响，个体沉淀剂的影响，个体ICIC对结对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散分光光度计、自动化生

20、化分析仪或散射比浊仪均可使用。射比浊仪均可使用。总评价缺点：缺点：测定结果与仪器测定结果与仪器的性能和试剂的质量的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。器和试剂价格比较贵。优点：优点：自动化自动化快速快速(30(3060s)60s)灵敏灵敏(g/L)(g/L)准确准确精密度高精密度高(CV5(CV5)稳定性好稳定性好节省试剂节省试剂检测范围广检测范围广不需减去样本和试剂不需减去样本和试剂本底值等优点。本底值等优点。(三)免疫比浊法主要影响因素1.抗原抗体比例抗原抗体比例2.抗体的质量抗体的质量3.抗原抗体反应的溶液抗原抗体反

21、应的溶液4.增浊剂的使用增浊剂的使用1 抗原抗体比例1.1.高剂量钩状效应（高剂量钩状效应（high dose hook high dose hook effect)effect)2.2.海德堡（海德堡（heidelbergerheidelberger）曲线理论曲线理论2 抗体的质量（1 1）特异性高）特异性高（2 2）效价高）效价高（3 3）亲和力高）亲和力高（4 4）抗血清来源）抗血清来源3 抗原抗体反应的溶液pH 6.58.5电解质电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）4 增浊剂的使用PEGPEG、tween-20tween-20等非离子型亲水剂等非离子型亲

22、水剂作用：消除蛋白质分子周围的电子作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。靠近，结合形成大分子复合物。本次实验内容实验一、双向免疫扩散试验实验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗鉴定及效价测定多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定实验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测 血清的采集与处理取血方法：血清的采集：耳缘静脉取血或颈动脉取血。血清处理：取好血后，放入取好血后，放入取好血后，放入取好血后，放入3737，30min30min后，使血清充分后，使血清充分后，使血清充分后，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经析出（不能冰冻，否则产生溶血），经析出（不能冰冻，否则产生溶血），经析出（不能冰冻，否则产生溶血），经3000rpm/5min3000rpm/5min分离血清分离血清分离血清分离血清，剩余放进剩余放进剩余放进剩余放进-20-20冰冰冰冰箱保存。箱保存。箱保存。箱保存。实验一、双向免疫扩散试验实验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗鉴定及效价测定多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定实验二、免疫浊度测定 免疫球蛋白检测免疫球蛋白检测实验步骤见说明书实验步骤见说明书IgG13g/L IgA2.62g/L IgM1.1g/L