药典版二部色谱法讲义.ppt

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1、药典版二部色谱法讲义何为色谱法何为色谱法 色谱法色谱法是利用混合物中各组分的是利用混合物中各组分的理化性质的差异理化性质的差异(吸附力、吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)，使各组分，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一相流过以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一相流过此固定相叫作流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受此固定相叫作流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，使得结

2、构上只有微小差异的各组分得到使得结构上只有微小差异的各组分得到分离分离。再配合相应的光学、。再配合相应的光学、电学、电化学和或其他相关检测手段，对各组分进行电学、电化学和或其他相关检测手段，对各组分进行定性和定量定性和定量分析分析的方法。的方法。色谱法的基本概念色谱法的基本概念分离原理l吸附色谱法l分配色谱法l离子交换色谱法 l排阻色谱法分离方法l纸色谱法l薄层色谱法l柱色谱法 l高效液相色谱法l气相色谱法色谱法的基本概念 特点l分辨效力l分析效率l灵敏度l操作及应用 局限性l标准物质l化学结构色谱法在中国药典中的沿革lV A 纸色谱法(1985)lV B 薄层色谱法(1985)lV C 柱色

3、谱法(1985)lV D 高效液相色谱法(1985)lV E 气相色谱法(1985)lV F 电泳法(1990)lV G 毛细管电泳法(2000)lV H 分子排阻色谱法(2000)lV J 离子色谱法(2010)高效液相色谱法在中国药典二部的应用中国药典2010年版色谱法内容概况lV A 纸色谱法lV B 薄层色谱法lV C 柱色谱法lV D 高效液相色谱法lV E 气相色谱法lV F 电泳法(1990)lV G 毛细管电泳法(2000)lV H 分子排阻色谱法(2000)lV J 离子色谱法(2010)V A 纸色谱法系以纸为载体，纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱

4、。l 鉴别l 纯度检查l 含量测定V B 薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上，经展开、检视后所得的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。V B 薄层色谱法 仪器与材料l薄层板(增“高效薄层板的粒径一般为57m”)l点样器l展开容器l显色剂(“碘蒸气中显色”修改为“适宜试剂的蒸气中熏蒸显色”)l显色装置l检视装置V B 薄层色谱法 操作方法l薄层板制备(110活化30分钟)l点样(点样基线距底边2.0cm，点样直径为24mm(高效薄层板为12mm)，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1.02.0cm(高效薄层板可不小于5mm)l展开(“

5、待展开至规定距离(一般为1015cm)”调整为“待展开至适宜的展距(如：20cm的薄层板，展距一般为1015cm；10cm的高效薄层板，展距一般为5cm左右)”l显色与检视V B 薄层色谱法 系统适用性试验l检测灵敏度(系指杂质检查时，供试品溶液中被测物能被检出的最低量。)l比移值(Rf)(除另有规定外，比移值(Rf)应在0.20.8之间。)l分离效能(鉴别时，在对照品与结构相似药物的对照品制成的混合溶液；杂质检查时，杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液溶解、用待测组分的对照品溶液溶解、供试品以适当的降解方法获得的溶液。应显示两个清晰分离的斑点)”V B 薄层色谱法 测定法l鉴别(同浓度对照品溶

6、液、供试品溶液与对照品溶液等体积混合)l杂质检查(杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法、或两者并用。通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量)烟酰胺P856V B 薄层色谱法 1 12 2 3 3 4 41 1、烟酰胺溶液、烟酰胺溶液2 2、烟酸溶液、烟酸溶液3 3、碱破坏溶液、碱破坏溶液4 4、混合溶液、混合溶液V C 柱色谱法l 吸附柱色谱l 分配柱色谱V D 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据

7、处理系统记录和处理色谱信号。V D 高效液相色谱法 (1)色谱柱l反相(非极性:C18、C8、CN、NH2)(组分的出峰顺序：极性大的先出峰，极性小的后出峰。)l正相(极性：硅胶)主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物(极性：固定相流动相)l离子交换l分子排阻l对映异构体V D 高效液相色谱法 (1)色谱柱n除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在310m之间，粒径更小(约2m)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。n使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定

8、的色谱条件的测定结果为准。V D 高效液相色谱法 (2)检测器选择性 紫外、荧光、电化学通用型 蒸发光散射、示差折光V D 高效液相色谱法 (3)流动相n反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统)，如经使用不合适时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。n其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过30%且相对于总量的改变量不超过10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的10%为限。V D 高效液相色谱法系统适用性试验l

9、 理论板数l 分离度l 重复性l 拖尾因子V D 高效液相色谱法测定法l 内标法l 外标法l 加校正因子的主成分自身对照法l 不加校正因子的主成分自身对照法l 面积归一化法司帕沙星P221消旋山莨菪碱P866硫酸卡那霉素P967氨基糖苷类抗生素蒸发光散射检测法阿米卡星P388柱前衍生化法V E 气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。V E 气相色谱法l载气源l进样部分l色谱柱l柱温箱l检测器l数据处理系统V E 气相色谱法检测器应用火焰离子化检测器（FI

10、D）有机化合物热导检测器（TCD）无机气体、有机化合物氮磷检测器（NPD）氮、磷化合物火焰光度检测器（FPD）硫、磷化合物电子捕获检测器（ECD）卤素等化合物质谱检测器（MS）结构确证V E 气相色谱法 各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。V E 气相色谱法 测定法l内标法l外标法l面积归一化法l标准溶液加入法 (当采用顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相

11、同的基质中，故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。)对于生产过程中引入的有机溶剂，应在后续的生产环节予以有效去除。除正文已明确列有“残留溶剂”检查的品种必须依法进行该项检查外，其他未在“残留溶剂”项下明确列出的有机溶剂与未在正文中列有此项检查的品种，如生产过程中引入或产品中残留有机溶剂，均应按附录“残留溶剂测定法”检查并应符合相应溶剂的限度规定。（凡例 十七）V E 气相色谱法头孢泊肟酯P198残留溶剂V F 电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶)中，在

12、电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量的方法。V G 毛细管电泳法是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据供试品中各组分的淌度(单位电场强度下的迁移速度)和(或)分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。盐酸头孢吡肟P671V H 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。头孢拉定P195V J 离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱

13、柱内进行分离后，经过抑制器或衍生系统进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。一、离子色谱的基本原理一、离子色谱的基本原理4242生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下4343生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下一、离子色谱技术的基本原理一、离子色谱技术的基本原理4444生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下淋洗液在线发生器淋洗液在线发生器不用化学试剂，只用水（不用化学试剂，只用水（RFIC）1.环保环保：不直接接触化学试剂：不直接接触化学试剂2.使用方便使用方便：只用水和鼠标，省时省力：只用水和鼠标，

14、省时省力3.重现性好重现性好：消除试剂杂质的干扰、配制溶液的：消除试剂杂质的干扰、配制溶液的误差和操作误差，结果更可靠。误差和操作误差，结果更可靠。4.增加增加IC的应用效能，的应用效能，提高灵敏度和分离度提高灵敏度和分离度，改，改善重现性，扩展应用，优良的不同时间和不同善重现性，扩展应用，优良的不同时间和不同实验室之间的可比性。实验室之间的可比性。5.普通等浓度泵即可作梯度淋洗普通等浓度泵即可作梯度淋洗，梯度淋洗和等，梯度淋洗和等浓度淋洗同样简单方便，延长泵的使用寿命。浓度淋洗同样简单方便，延长泵的使用寿命。4545生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下 检测方式

15、检测方式v电导电导 检测具有电导性化合物的通用型检测器检测具有电导性化合物的通用型检测器离子色谱最常用的检测器离子色谱最常用的检测器 v安培法安培法 在特定的条件下可对某些化合物直接进行氧化还原反在特定的条件下可对某些化合物直接进行氧化还原反应应 v紫外可见光度法紫外可见光度法 紫外直接吸收或可见光光度法测定选择性强紫外直接吸收或可见光光度法测定选择性强 可进行可进行柱后衍生柱后衍生v荧光法荧光法 HPLC v质谱质谱4646生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下一、离子色谱技术的基本原理一、离子色谱技术的基本原理4747生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技

16、泽天下技泽天下技泽天下一、离子色谱技术的基本原理一、离子色谱技术的基本原理4848生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下一、离子色谱技术的基本原理一、离子色谱技术的基本原理4949生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下 样品的前处理o0.22，0.45um滤膜滤膜去除颗粒状杂质去除颗粒状杂质oC18预处理小柱、预处理小柱、On-Guard RP柱柱去除有机分子去除有机分子o石墨化碳黑柱石墨化碳黑柱去除色素去除色素oOn-Guard P柱柱去除土壤中腐殖酸、苯环类的化合去除土壤中腐殖酸、苯环类的化合物物oOn-Guard H、Na柱柱去除溶

17、液中的金属离子去除溶液中的金属离子oOn-Guard Ag柱柱去除溶液中的去除溶液中的Cl-离子，主要测定离子，主要测定高氯（海水）物质中的高氯（海水）物质中的NO2-，NO3-等离子等离子o在线离线除糖在线离线除糖氨基酸样品分析时，除去糖对氨基酸氨基酸样品分析时，除去糖对氨基酸检测时的干扰检测时的干扰5050生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下离子色谱离子色谱法法应用应用 5151生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下三、离子色谱在药品分析中的应用三、离子色谱在药品分析中的应用5252生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下

18、技泽天下技泽天下三、离子色谱在药品分析中的应用三、离子色谱在药品分析中的应用5353生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下三、离子色谱在药品分析中的应用三、离子色谱在药品分析中的应用5454生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下三、离子色谱在药品分析中的应用5555生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下三、离子色谱在药品分析中的应用三、离子色谱在药品分析中的应用5656生命至上生命至上生命至上生命至上 技泽天下技泽天下技泽天下技泽天下人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。