实验二、PCR(不跑电泳)讲课教案.ppt

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1、实验二、PCR(不跑电泳)全触摸屏PCR仪（Bio-Rad）什么是聚合酶链式反应（什么是聚合酶链式反应（PCR）？）？聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction，PCR）是模拟）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩的复制过程，在体外特异性扩增增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过经过n次循环后，模板分子数变为原来的次循环后，模板分子数变为原来的2n倍倍。lKhorana(1971)等最早提出等最早提出核酸核酸体外扩增的设想：体外扩增的设

2、想：“经经DNA变性变性，与合适，与合适的引物的引物杂交杂交，用，用DNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基基因。因。”l1985年，年，Kary Mullis在在Cetus公司工作期间，发明了公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。而烦恼。l1983年年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出猛然闪现出“多多聚酶链式反应聚酶链式反应”的想法。的想法。l1983年年1

3、2月，月，Mullis用同位素标记法看到了用同位素标记法看到了10个循环后的个循环后的49 bp长度的第一长度的第一个个PCR片段；片段；l1985年年10月月25日申请了日申请了PCR的专利，的专利，1987年年7月月28日批准（专利号日批准（专利号4,683,202），），Mullis是第一发明人；是第一发明人；l1985年年12月月20日在日在Science杂志上发表了第一篇杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，的学术论文，Mullis是是共同作者；共同作者；l1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的

4、方法。的方法。20212223N:Molecular numberN0:Original numbern:Cycles E:efficiencyN=N0X2n PCR的指数扩增的指数扩增N=N0X（1+e)nPCR扩增过程扩增过程DNA模板模板变变性性退火退火:引物引物 +模板模板新链新链延伸延伸50607230-40次循环次循环引物引物耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶退火温度：退火温度：45-60 延伸时间：延伸时间：1-2kb/min循环数：循环数：30-40PCR试剂的作用及使用浓度范围1、DNA模板模板(template)：噬菌体的噬菌体的质粒质粒DNA(几纳克几纳克几微克几微克)2、d

5、NTP:4种种dNTP混和物。混和物。20-200umolL。大于。大于50mmol/L可抑制可抑制Taq酶的活性。酶的活性。3、10 PCR缓冲液缓冲液(buffer):组分如下组分如下:15mmol/L MgCl2（影响引物退火和解链的温度，影响产物的特异性，影响引物二聚（影响引物退火和解链的温度，影响产物的特异性，影响引物二聚体的形成。浓度范围：体的形成。浓度范围：0.5-2.0mmol/L。浓度太低无。浓度太低无PCR扩增，太高则会出现非特异扩增，太高则会出现非特异性扩增）性扩增）500mmol/LKCl(有利于引物与模板退火，浓度太高则抑制酶活性有利于引物与模板退火，浓度太高则抑制酶

6、活性)、100mmol/L Tris.HCl(pH8.3)（缓冲（缓冲PH）0.1%明胶明胶（稳定酶的活性）（稳定酶的活性）4、引物引物(primer):上游引物（上游引物（M13 F），下游引物（），下游引物（M13 R）（引物终浓度：）（引物终浓度：0.2-1.2umol/L）6、Taq DNA聚合酶聚合酶分子克隆分子克隆3提供的提供的PCR 标准反应条件：标准反应条件：模板模板1pg-1g引物引物1mol/LDNA 聚合聚合酶酶15 单单位位Mg2 1.5mmol/LdNTPs 200mol/LKCl 50 mmol/L影响影响PCR反应的关键因素反应的关键因素1.引物的质量与特异性；引

7、物的质量与特异性；2.PCR循环条件（退火温度）；循环条件（退火温度）；3.Mg2+浓度；浓度；4.模板模板DNA的质量；的质量；5.酶的质量。酶的质量。DNA模板模板1.模板模板浓浓度：度：0.01-1 ng（plasmid,phage）；）；0.1-1 ug（genomic DNA）；）；10倍稀倍稀释释（cDNA）;2.模板中是否含有蛋白模板中是否含有蛋白质杂质质杂质3.模板中是否含有模板中是否含有Taq酶酶抑制抑制剂剂（苯酚）（苯酚）Enzyme concentration TaqDNApolymeraseisbetween1and2.5units.催催化化一一典典型型的的PCR反反应

8、应约约需需酶酶量量2.5U(指指总总反反应应体体积积为为100ul时时)，浓浓度度过过高高可可引引起起非非特特异异性性扩扩增增，浓浓度度过过低低则则合合成产物量减少成产物量减少dNTP A working stock containing 1 mM each dNTP is recommended dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，扩增效率有密切关系，多多次冻融会使次冻融会使dNTP降解。降解。Mg2+Mg2+浓度：浓度：0.5-2.5 mM较合适。较合适。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低出现非特异扩增，浓度

9、过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，聚合酶的活性，使反应产物减少。使反应产物减少。Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓浓度为度为1.52.0mmol/L为宜。为宜。引物浓度：引物浓度：引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。变性温度和时间变性温度和时间 ：94-95 C for 30 seconds。变性

10、不完全变性不完全,往往使往往使PCR 失败失败，但变性温度过高或时间过，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失长都会导致酶活性的损失。退火温度：退火温度：通常通常PCR的退火温度选择为的退火温度选择为Tm-5 oC;退火温度越高退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环,既省时既省时间又提高了特异性。间又提高了特异性。引物为引物为20mer以下时：以下时：Tm=2(A+T)+4(G+C)引物为引物为20mer以上时：以上时：Tm=81.5十十0.41(GC)-600/L

11、 其中其中L为引物的长度。为引物的长度。延伸时间：延伸时间：1-2kb/min.延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后完成后,都需要一步较长时间都需要一步较长时间(10min)的延伸反应的延伸反应,以获得尽以获得尽可能完整的产物。可能完整的产物。循环数：循环数：35 cycles 循环次数过多，会使循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。产物中非特异性产物大量增加。退火温度对退火温度对PCR产物量和特异性的影响产

12、物量和特异性的影响PCR常见问题常见问题假阴性：假阴性：无无扩扩增条增条带带（漏加模板、引物或（漏加模板、引物或酶酶；酶酶失效等；引物失效等；引物不合适）不合适）假阳性：假阳性：非特异性非特异性扩扩增增带带（退火温度偏低；引物不合适；（退火温度偏低；引物不合适；Mg2+浓浓度不合适）；度不合适）；为为什么可以通什么可以通过过PCR扩扩增得到特异片段增得到特异片段模板DNA1st2nd3rd特异性扩展片段%=0%特异性扩展片段%=25%特异性扩展片段%=50%4th特异性扩展片段%=68.75%.PCR的特点的特点简便、快速简便、快速一次性加好反应液，一次性加好反应液，13 小时完成扩增，扩增产

13、物一般用电泳方小时完成扩增，扩增产物一般用电泳方法即可检测分析法即可检测分析对标本的要求低对标本的要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等的粗提血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等的粗提DNA灵敏度高灵敏度高 理论上理论上13个个DNA分子经分子经PCR扩增可获得百万以上个相同的扩增可获得百万以上个相同的DNA分子分子特异性强特异性强扩增的产物与模板分子特异区域完全相同扩增的产物与模板分子特异区域完全相同PCR的应用的应用研究研究基因克隆，基因克隆，DNA测序，分析突变测序，分析突变诊断诊断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤检测和诊断，转基因产细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤检测和诊断，转

14、基因产品的检测，动植物检疫品的检测，动植物检疫法医法医犯罪现场标本分析犯罪现场标本分析其他其他实验材料与试剂实验材料与试剂1、DNA模板模板(template)：噬菌体的噬菌体的质粒质粒DNA2、dNTP:4种种dNTP混和物混和物3、10 PCR缓冲液缓冲液(buffer):组分如下组分如下:15mmol/L MgCl2 500mmol/LKCl 100mmol/L Tris.HCl(pH8.3)0.1%明胶明胶4、引物引物(primer):上游引物（上游引物（M13 F），下游引物（），下游引物（M13 R）（见）（见“实验指导实验指导”）6、Taq DNA聚合酶聚合酶(Taq polym

15、erase)PCR的基本步骤的基本步骤1、PCR反应体系的建立反应体系的建立取取0.2ml的薄壁离心管，按的薄壁离心管，按表表1顺序加入试剂顺序加入试剂稍混匀，稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。短暂离心把溶液甩至管底。2、PCR的变温程序（热循环反应）的变温程序（热循环反应）按按表表2设置设置PCR反应的变温程序反应的变温程序把离心管放进把离心管放进PCR仪进仪进行扩增行扩增反应结束后低温保存或检测反应结束后低温保存或检测3、PCR扩增产物的电泳检测扩增产物的电泳检测(下次实验下次实验)PCR的基本步骤的基本步骤1、PCR反应体系的建立（反应体系的建立（2人一组）人一组）取取0.2ml的薄壁离心

16、管，按的薄壁离心管，按表表1顺序加入试剂顺序加入试剂稍混匀，短暂离心把溶液甩稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。至管底。试剂标记试剂标记成份成份1份体积份体积(l)H2OddH2O17.3Buffer10反应缓冲液反应缓冲液2.5dNTPdNTPs(2.5mM each)2P1引物引物1（10uM）1P2引物引物2（10uM）1DNADNA1rTaqrTaq酶酶0.2总体积总体积25表表1 PCR 反应体系反应体系2、PCR的变温程序的变温程序（热循环反应）（热循环反应）按按表表2设置设置PCR反应的变温反应的变温程序程序把离心管放进把离心管放进PCR仪进行扩增仪进行扩增反应结束后反应结束后低温保

17、存或检测低温保存或检测反应阶反应阶段段循环循环数数 温度温度持续时间持续时间11 94（预变性）（预变性）3min235 94（变性）（变性）30s 52（退火）（退火）30s 72（延伸）（延伸）30s31 72（补充延（补充延伸）伸）10min 41 12置于置于12 可短时间可短时间保存保存PCR产物；若产物；若需长时间需长时间保存取出保存取出后置后置-20 保存保存表表2 PCR反应的变温程序反应的变温程序引物设计引物设计PCR引物设计的原则引物设计的原则p引物长度：引物长度：16-30nt(202nt)pG+C%：40-60%p四种碱基应随机分布，在四种碱基应随机分布，在3末端不存在

18、连续末端不存在连续3个个G或或Cp在引物内，尤其是在在引物内，尤其是在3端不应存在二级结构（引物内互补配端不应存在二级结构（引物内互补配对）对）p两个引物之间，尤其是两个引物之间，尤其是3端不能互补。两引物间最好不存在端不能互补。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源性或互补性p引物的引物的5端对扩增影响不大，可在引物设计时根据实验需要端对扩增影响不大，可在引物设计时根据实验需要加上一定的接头或修饰加上一定的接头或修饰p引物不与模板结合位点以外的序列互补引物不与模板结合位点以外的序列互补pTm通常在通常在50-60度之间。度之间。Tm值值=4(G+C)+2(A+T)引物设计的软件引物设计的软件pPrimer Premier 5pOligo6pvPrimer3（在线服务）（在线服务）下次实验下次实验琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢