分子克隆工具酶及其应用.ppt

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1、分子克隆工具酶及其应用 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 l核酸聚合酶核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 l核酸连接酶核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 l其其它它酶酶类类-用于生物细胞的破壁、转化、

2、核酸纯化、检测等。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶一一.限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现细菌限制修饰系统的发现WernerArber于于1962-1968年发现，年发现，1968年分离到年分离到I型限制酶。型限制酶。2.限制酶限制酶HindII的发现的发现HOSmith和和Wilox于于1970年首次从流感嗜血年首次从流感嗜血杆菌（杆菌（H.influenzae）中发现并分离到）中发现并分离到HindII限制酶。限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用年）用HindII绘制绘制SV40的限

3、制的限制酶谱。酶谱。二二.限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类1.I型型：由三个基因构成，由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。腺苷甲硫氨酸）。2.II型型：限制与修饰基因产物独立起作用，在限制与修饰基因产物独立起作用，在.coli中这两种基因位于质粒上。中这两种基因位于质粒上。3.III型型：修饰酶与型酶相同，修饰酶与型酶相同，h

4、sd与与hsd基基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。基因工程中。三三.限制性内切酶的定义、命名限制性内切酶的定义、命名1.定义定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指狭义指II型限制酶。型限制酶。2.命名命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。菌系编号、分离顺序。例如：例如：Hind前三个字

5、母来自于菌种名前三个字母来自于菌种名称称H.influenzae，“”表示菌系为型血表示菌系为型血清型；清型；“”“”表示分离到的第三个限制酶。表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coliRIHindHaemophilusinfluensae dSacI(II)Streptomycesachromagenes I()四四限制酶的特点限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点识别顺序和酶切位点）识别）识别-8个相连的核苷酸个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CC BamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPy NotIGCGGCCGC；Sfi

6、IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG FokI5-()9-33-()13-5外侧，产生外侧，产生-端突端突起起）富含）富含）对称性）对称性双双对称对称EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-2.末端种类末端种类）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸Pst I5-CTGCAG-35-CTGCAG-33-GACGTC-53-GACGTC-5）-端突起端突起，个数为或个核苷酸，个数为或个核苷酸EcoRI5-G

7、AATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5）平齐末端平齐末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5）非互补的粘性末端）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：）切点在识别顺序之外的，如：FokI FokI5-GGATG()9-35-GGATG(N)93-CCTAC()13-53-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5-CPyCGPuG-3CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG）相容性末端）相容性末端如：如：BamHIGGATCC Bg

8、lIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN上上述述几几种种限限制制酶酶产产生生的的DNA片片段段仍仍可可相相连连，由由此此形形成成的的重重组组分分子子能能被被MboI和和Sau3AI识识别别和和酶酶切切，但但BamHI和和BglII的的识识别别机机率率只有只有1/16。BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/ABamHI和和BglII(AGATCT)两两种种酶酶产产生生的的相相容容性性末末端端，相相连连后后不不能为两种酶所识别和酶切。能为两种酶所识别和酶切。BamHI+BglIIA/GGATCT/C 不同末端的连接特性不同末端的连接特性:除第除第4 4种末端不能进行不

9、同种末端不能进行不同DNA分分子或同种子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余分子不同切点产生的末端相连外，其余4 4种种末端可以相互连接。末端可以相互连接。五五.异源同序酶异源同序酶（isoschizomer，同裂酶），同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制种限制酶酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG六六.限制酶的星反应（限制酶的星反应（staractivity）七七.1.特点特点:限制酶识别

10、序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低2.发生星反应的限制酶和条件发生星反应的限制酶和条件（见下页）（见下页）3.星反应的利用和避免星反应的利用和避免表表1 1 具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI 1,2,4I 1,2,4BamBamHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCBstBstI 2,4I 2,4BsuBsuI 2,4,6I 2,4,6EcoEcoRI 1,2,4-6 N AATTNRI 1,2,4-6 N AATTNHa

11、eHae 2,4 2,4HhaHhaI 2,4,7I 2,4,7HinHind 6d 6HpaHpaI 1,2,4I 1,2,4PstPstI 1,2,4,7I 1,2,4,7PvuPvu 2,4 2,4SalSalI 1,2,4,7I 1,2,4,7ScaScaI 4-6,8 I 4-6,8 SstSst 2,4 2,4XbaXbaI 2,4,7I 2,4,7a.1a.1：亚乙二醇：亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12%)(12%)；4 4：高酶：高酶/DNA/DNA比比(25U/g)(25U/g)；5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8

12、.5;7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%);8:无无NaCl。七七.其它特异性的内切酶及其用途其它特异性的内切酶及其用途1.末端酶（末端酶（terminase）：）：5-GGGCGGCGACCTN-3N-5，出现的频率约，出现的频率约412分子量为分子量为117,000=1A（74,000）+2Nul（21,000）2.Omega核酸酶（核酸酶（I-SceI）：）：由内含子编码，用于由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约的剪切，出现的频率约418=6.9X1010bp，其识别顺序为其识别顺序为5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3TATT3.I-PpoI：来自于来自于Physarum

13、 polycephalum识别序列：识别序列：CTCTCTTAAGGTAGCAATT4.用途用途遗传标记，遗传标记，构建载体构建载体八八.限制酶的用途限制酶的用途1.DNA重组重组2.限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（突变分析（RFLP分析）分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切附：附：IIS型限制酶的特点型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，点的一侧，1-20nt。

14、3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。个核苷酸。5.均为单体，分子量为均为单体，分子量为47108kD。第二节第二节DNA甲甲 基基 化化 酶酶一一.甲基化酶的种类与识别顺序甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤：甲基腺嘌呤：在在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属

15、于重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同不同MHpaICmCGGHpaICCGG相同相同2.Ecoli的的dam、dcm甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。饰系统。damGmATC，dcmCmCA/TGG3.哺乳动物的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与中的胞嘧啶甲基化

16、，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。复制、基因转录等过程有关。4.Ecoli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）二二.甲基化酶活性对限制酶活性的影响甲基化酶活性对限制酶活性的影响1.dcm和和dam甲基化酶对限制酶的影响甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠如：完全重叠BclIdam(GATC)；ScrFIdcm(CCA/TGG)边界重叠边界重叠ClaI-da

17、m；Sau96I-dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠叠如：如：dam-BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI；dcm-BstNI表表2 2 对甲基化敏感的限制性内切酶对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶限制酶 识别序列识别序列*甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmBclBcl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG

18、dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA dam damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmSauSauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam *下横线字母表示限制酶识别序列下横线字母表示限制酶识别序列,绿色字母表示绿色字母表示da

19、mdam甲基甲基化酶识别序列化酶识别序列,红色字母表示红色字母表示dcmdcm甲基化酶识别序列甲基化酶识别序列2.II型甲基化酶型甲基化酶对限制酶活性的影响对限制酶活性的影响）抑制同种限制酶的活性抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCCBamHI(G GATCC)M.EcoRIGAmATTCEcoRI(G AATTC)）抑制不同种限制酶的活性抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠顺序完全重叠如：如：M.ClaI（ATCGmAT）-TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠顺序边界重叠如：如：M.BamHI（GGATmCC）-MepI（mCCGG）抑制不同种限制酶的部分活性抑制不同种限制酶的

20、部分活性MTaqI（TCGmA）-HindII（GTPyPuAC）：）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途甲基化酶的用途）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成）在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然分子部分甲基化，然后再用限制酶切后再用限制酶切表表3 3 甲基化酶与识别序列甲基化酶与识别序列甲基化酶甲基化酶 识别序列识别序列a a 受甲基化影响的限制酶受甲基化影响的限制酶b b M.Alu AG M.Alu AGmCT CT Alu Alu,BamBamH,H,

21、BspBsp12861286 DdeDde,HgiHgiA,A,NheNhe,Pst Pst M.BamH GGAT M.BamH GGATmCC CC BamBamH,H,MspMsp M.Cla ATCG M.Cla ATCGmAT AT Cla Cla,MboMbo,TaqTaq dam G dam GmATCATC c c dcm CCA/TGG dcm CCA/TGG c c M.EcoR GA M.EcoR GAmATTC ATTC EcoEcoRR M.HI M.HId d GCNGC GG GCNGC GGmCC CC MstMst,PstPst,PvuPvu M.Hae GG

22、 M.Hae GGmCC CC BanBan,BglBgl,BspBsp1286,1286,BstBstX,X,HaeHae,MspMsp,NaeNae,NcoNco,SacSac,SauSau9696 M.Hha G M.Hha GmCGC CGC AhaAha,FnuFnuD,D,HhaHha M.Hpa C M.Hpa CmCGG CGG AhaAha,AvaAva,AvaAva,HpaHpa,ScrScrFF M.Hph T M.Hph TmCACC CACC HinHinf,f,HphHph,SauSau3A3A M.Msp M.Msp mCCGG CCGG BamBamH,H,Ms

23、p Msp M.Pst CTGC M.Pst CTGCmAG AG AluAlu,PstPst M.Taq TCG M.Taq TCGmA A AluAluI,I,AvaAva,EcoEcoRV,RV,HinHinC,C,HinHinf,f,MboMbo,TaqTaq,XmnXmna.a.标在碱基的左上角的标在碱基的左上角的m m表示该碱基被甲基化表示该碱基被甲基化;b.;b.所列出的限制酶均已商品化所列出的限制酶均已商品化;c.;c.参见表参见表2;2;d.M.HId.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGCGCNGC的甲

24、基化位点尚未确定。的甲基化位点尚未确定。M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连与载体相连甲基甲基化酶化酶人工人工接头接头RE用于基因组文库的建立用于基因组文库的建立用于用于cDNA的连接的连接RERERE第三节第三节核核 酸酸 酶酶ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HOP53HOP5一一.外切酶外切酶III（ExoIII）1.一般特点：一般特点：来自于来自于E.coli，分子量，分子量28,000kD2.催化反应类型催化反应类型1)外切酶活性外切酶活性：35，产

25、生，产生5-单磷酸核苷酸和单磷酸核苷酸和具各种结构的具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶核酸酶H活性：除去活性：除去DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA分子，分子，pH7.6-8.53)3-磷酸酶活性：除去磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成磷酸基后形成3-OH端，端，有利于有利于DNA聚合酶反应，聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切键切开，开，pH7.6-8.53.外切酶活性特点外切酶活性特点1)反应底物：互补反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：反应产物

26、：5-单磷酸核苷和具缺口或单磷酸核苷和具缺口或5-端突起端突起的的ds-DNA，过度反应将导致，过度反应将导致DNA降解降解4.用途用途1)核酸（核酸（DNA）标记）标记2)基因突变基因突变-缺失缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，在一定条件下，ExoIII不能作用不能作用GC富集区富集区(来来自于自于cDNA加尾加尾)5P5P5P5P5P3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HO3HOOH3OH3OH3OH3P5P5P5P5P5P5P53HOP5

27、OH3P5RNaseHExoIII的外切酶和的外切酶和RNaseH的作用的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失用于顺序缺失ExoIIIExoIII-32P-32PdCTPdCTP5PP55PP53HOOH33HOOH3ExoIII用于用于DNA标记标记二二.外切酶外切酶1.反应特点反应特点1)作用底物作用底物:要求要求5-PO4基基;不作用含切口的不作用含切口的DNA分分子子2)作用方向与产物：作用方向与产物：53;产生产生5-P核苷和核苷和3-突起的突起的ds-DNA2.用途：用途：DNA定序测

28、定定序测定;除去除去5-端突起，产生端突起，产生3-端突端突起，便于加尾起，便于加尾3HO3HO3HOOH3OH3OH35P5P5PP5P5P5AAAAAAAAAAAATdT+dATP三三.核酸酶核酸酶Bal311.一般特点：一般特点：胞外酶；具胞外酶；具DNase和和RNase活性；由活性；由“快快”和和“慢慢”两种成分构成两种成分构成2.催化反应特点催化反应特点1)底物：底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性外切与内切活性)2)作用方向与产物：作用方向与产物：53和和35同时进行，但反同时进行，但反应速度不同；应速度不同；产生产生5-单磷酸核苷和缩短的单磷酸核苷和缩短的d

29、s-DNA3.用途：用途：基因突变基因突变-缺失缺失;绘制限制酶谱绘制限制酶谱;DNA定序定序(与与ExoIII相同相同)，其优点是，其优点是Bal31酶活依赖于酶活依赖于Ca+和和Mg+，Ca+在反应完毕后可用在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不（乙二醇四乙酸）灭活而不影响影响Mg+浓度，后者是限制酶活性必需的浓度，后者是限制酶活性必需的4.使用注意事项：使用注意事项：1)应作预备实验，因每批酶制品的应作预备实验，因每批酶制品的“快快”“慢慢”酶含量不酶含量不同同2)DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平起，需要补平5P

30、P53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性四四.核酸酶核酸酶S11.一般特点：一般特点：糖蛋白糖蛋白(含糖量含糖量8%)，最佳，最佳pH4.5，对热对热稳定，抗变性剂稳定，抗变性剂2.催化反应类型催化反应类型:ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区双螺旋变性区3.用途用途1)基因突变基因突变-缺失，常与外切酶，如缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、外切酶、Bal31连用连用2)DNA定序分析定序分析3)S1作图法作图法4)基因结构分析基因结构分析5)tRNA结构分析结构分析4.使用注意事项使用注意事项1)避避免免长长时时间间反反应应，因因最最适适酸酸性性pH将将导导致致DNA断

31、断裂裂或或降降解解2)避免使用高浓度酶量，以免避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解被降解(因产生切口因产生切口)ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性五五.绿豆核酸酶绿豆核酸酶1.与与S1酶相同点：酶相同点：作用于作用于ss-DNA和和RNA，对，对5-端的突起核苷酸作用速度为端的突起核苷酸作用速度为GCAT2.与与S1酶的不同点酶的不同点最适最适pH接近中性，不会产生切口接近中性，不会产生切口;不使具切口的不使具切口的ds-DNA断裂断裂3.用途：用途：与与S1酶相同酶相同六六.外切酶外切酶作用于作用于ss-DNA的的3-与与5-

32、端，产物为低聚核苷酸端，产物为低聚核苷酸除去单链除去单链DNA形成平整末端形成平整末端七七.牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶作作用用含含5-羟羟基基端端的的ss-DNA和和RNA，产产生生3-单单磷磷酸酸核核苷苷用于短链用于短链RNA和和DNA的定序分析的定序分析八八.蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶作用作用3-羟基单、双链羟基单、双链DNA和和RNA，产生，产生5-单磷酸核苷单磷酸核苷用于用于RNA和和DNA的定序分析的定序分析表表4几种常用外切酶的特点几种常用外切酶的特点外切酶外切酶作用方向作用方向作用底物作用底物反应产物反应产物ExoIII35dsDNA单核苷酸单核苷酸外切酶外切酶53ss和和d

33、sDNA同上同上Bal3135和和53ss和和dsDNA,RNA同上同上S135和和53ssRNA和和ssDNA低、核苷酸低、核苷酸绿豆核酸酶绿豆核酸酶35和和53ssRNA和和ssDNA同上同上ExoVII35和和53ssDNA低聚核苷酸低聚核苷酸牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶53ssRNA，ssDNA同上同上蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶35ss，dsRNA和和DNA同上同上九九.RNase大部分用于大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。分子。RNase的识的识别序列和特点见别序列和特点见表表5。1.RNa

34、seA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNA样品中样品中的的RNA分子分子2.核酸酶核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA十十.RNaseH作用于作用于DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文库建立时除去文库建立时除去DNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的合成。链的合成。表表5核糖核酸酶反应特点核糖核酸酶反应特点核酸酶核酸酶特异性反应特异性反应核酸酶核酸酶特异性反

35、应特异性反应APyp/NPhyMAp/N或或Up/NCL3Cp/N,Ap/N和和Cp/N B.cereusCp/N,Up/NT1Gp/NP1无特异性反应无特异性反应T2无特异性反应无特异性反应S7Np/A和和Np/UU2Pup/N或或Ap/NPhy1Ap/N,Gp/N和和Up/N十一十一.DNaseI1.特点：特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核，但无核苷酸序列特异型，产生苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值可使酶活达最大值当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，分子上将形成

36、切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途用途1)切口移位切口移位，制备，制备DNA探针探针2)制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子3)基因突变时产生切口基因突变时产生切口Mn+存在时存在时Mg+存在时存在时DNaseI作用特点作用特点DNaseIHOP535353DNaseI与与PolI的的切口移位切口移位PolI第四节第四节DNA聚聚 合合 酶酶一一.E.c

37、oli DNA聚合酶聚合酶I（polI）1.E.coli的的DNA聚合酶系统聚合酶系统PolI参与参与DNA修复修复,具具35和和53外切酶活性外切酶活性polII同上同上具具35外切酶活性外切酶活性polIII参与参与DNA复制复制,具具35和和53外切酶活性外切酶活性2.E.colipolI的特点的特点1）具两种外切酶活性和）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片大片段亦称为段亦称为Kleno

38、w片段片段,polIK)2）聚合酶活性，聚合酶活性，53,要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其，其延续性受反应条件的影响（延续性受反应条件的影响（表表6）3）外切酶活性外切酶活性3.用途用途1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大片段常用大片段表表6E.coli DNAPolI的延续性的延续性DNA模板模板-引物类型引物类型反应条件反应条件延续性延续性(碱基数碱基数)切口切口ColE137C,低盐低盐8缺口缺口ColE13

39、7C,低盐低盐47切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA37C,低盐低盐24polyd(AT)37C,低盐低盐188polyd(AT)5C,低盐低盐14polyd(AT)5C,高盐高盐3二二.T4DNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：53聚合酶活性，聚合酶活性，1500nt/min,为为polI的两倍的两倍35外切酶活性，可作用于外切酶活性，可作用于ss-DNA和和dsDNA,其其切除速度分别为切除速度分别为40和和4000nt/min2.用途：用途：制备高比活性探针制备高比活性探针(1010cpm/gDNA);DNA末端修末端修饰饰-缺失缺失5CAGCAACGT3dATPCAGCAACGT3S1T33

40、GTCGTTGCA5T4聚合酶聚合酶A5A5外切酶活性外切酶活性聚合酶活性聚合酶活性无无dNTPdNTP三三.反转录酶反转录酶1.AMV反转录酶反转录酶1）结构与酶活性结构与酶活性反转录酶以反转录酶以，形式存在，形式存在，其中其中（无活性）（无活性）P32（内切酶活性）（内切酶活性）+聚合聚合酶酶+P24（RNaseH活性），各步反应由蛋白酶催活性），各步反应由蛋白酶催化化2）聚合酶活性）聚合酶活性a.RNA，DNA引物（大于引物（大于8nt）cDNA链链bDNA-RNA引物引物互补互补DNA链链c(rA)1100(dT)12-18(dT)nor(rc)n.dGn(dG)n反转录酶的结构和活性

41、反转录酶的结构和活性 P24 P24190kD160kD65kD24kDP32RNaseH聚合酶聚合酶5AAAAA3引物引物5AAAAA3TTTTT5反转录反应反转录反应53533535 全长全长cDNA提前终止反应提前终止反应2.M-MLV反转录酶反转录酶1)特点：特点：不具内切酶活性不具内切酶活性;RNaseH活性低活性低;稳定性差稳定性差2)与与AMV反转录酶比较反转录酶比较a合成短链合成短链cDNA(0.6kb)时，两者相同，但时，两者相同，但M-MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关b合成长链合成长链cDNA(4.5-7.5kb)时，它比时

42、，它比AMV反转反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。3)用途用途a.cDNA合成用于文库建立合成用于文库建立;b.制备制备cDNA探针探针;c.DNA序列分析序列分析;d.填补填补5-突起末端以获平端突起末端以获平端四四.TaqDNA聚合酶聚合酶1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反，最适反应温度应温度75，对对95高温具良好稳定性，该酶不存高温具良好稳定性，该酶不存在在35外切酶活性外切酶活性2.用途：用途：主要用于主要用于DNA的体外扩增，经的体外扩增，经25次循环后才次循环后才进入酶的反应稳定期

43、，一个进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增分子因而可被扩增4106倍倍DNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括，它包括以下三个步骤：以下三个步骤：DNA模板变性模板变性(95)与与DNA引物退火引物退火(45)引物延伸引物延伸(75)TaqPol和和PCR53变性变性3553引物引物35复性复性535335引物引物3553延伸延伸533535五五.DNA定序酶定序酶用基因工程方法去除用基因工程方法去除35外切酶活性的外切酶活性的TaqDNA聚合酶聚合酶六六.TthDNA聚合酶聚合酶93kD，75，含有二级结构，含有二级结构DNA分子的定序分子的定序七七.

44、TliDNA聚合酶聚合酶100仍具酶活，仍具酶活，35外切酶活性，外切酶活性，85kDDNA的切平反应和补平反应的切平反应和补平反应DNA聚合酶和核酸酶聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用或绿豆核酸酶连用,可用于可用于DNA末端结构的修饰末端结构的修饰5AAGCTT3HindIII5AAGCTT33TTCGAA53TTCGAA5S1dNTP+klenowfrag5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA5T4DNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶5AT35AAGCTAGCTT33TA53TTCGATCGAA5切平反应和补平反应切平反应和补平反应四种不同补平反应四种不同补平反

45、应5-GGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-CCTAGG-53-CCTAGG-5dNTPdGTPdGTP/dATPdGTP/dATP/dTTP5-GGATC5-GG5-GGA5-GGAT3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAG3-CCTAGGATCC-3GATCC-3GATCC-3GATCC-3CTAGG-5GG-5AGG-5TAGG-5IS1S1S15-GGCC-35-GGATCC-35-GGATATCC-33-CCGG-53-CCTAGG-53-CCTATAGG-5IIIII第第 五五 节节RNA聚聚 合合 酶酶一一.SP6RNA聚合酶聚合酶1、特点：、特点：依赖于依赖于DN

46、A的的RNA聚合酶，具聚合酶，具SP6启动子特异型启动子特异型2、用途：、用途：主要用于主要用于RNA分子的体外合成，分子的体外合成，RNA分子可用于：分子可用于：1）RNA分子的拼接研究分子的拼接研究2）标记的标记的RNA常用于杂交，常用于杂交，RNA-DNA比比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生分子更稳定，两条链均可标记，产生的的RNA具高放射比活性具高放射比活性3）DNA的定序分析的定序分析4）基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置位置5）还可以用于蛋白质的合成研究还可以用于蛋白质的合成研究RNA聚聚合合酶酶活活性性二二.T7

47、RNA聚合酶聚合酶特异性识别特异性识别T7噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子三三.T3RNA聚合酶聚合酶特异性识别特异性识别T3噬菌体基因启动子噬菌体基因启动子基因启动子识别的特异性比较：基因启动子识别的特异性比较：SP6T7T3四四.E.coliRNA聚合酶聚合酶五五.多聚核苷酸磷酸化酶多聚核苷酸磷酸化酶第第 六六 节节连连 接接 酶酶一一.T4DNA连接酶连接酶1.特点：特点：只连接只连接ds-DNA分子，要求分子，要求3-羟基和羟基和5-磷酸基磷酸基2.用途：用途：1)相同或相容粘性末端的连接相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果平端来源：限

48、制酶作用结果;限制酶与其它限制酶与其它酶共同作用结果酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多困难得多，所需的酶量也多3.抑制剂：抑制剂：PO43-5mM,NaCl25mM,Ca+0.1mM5-AAGCTT-35-AOHPAGCTT-3PAGCTTAOH3-TTCGAA-53-TTCGAPHOA-5HOATTCGAP退火退火5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5或或5-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-33-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5T4DNA连接酶连接酶5-AAGCTT

49、AAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5或或5-AAGCTTAAGCTT-33-TTCGAATTCGAA-5T4DNA连接酶的连接反应连接酶的连接反应(两种插入方向两种插入方向)+二二.E.coli DNA连接酶连接酶只能连接具粘性末端只能连接具粘性末端DNA分子，以分子，以NAD作辅助因子作辅助因子三三.T4RNA连接酶连接酶参与单链参与单链RNA分子的连接。分子的连接。主要用于提高主要用于提高T4DNA连接连接酶在连接反应中的连接效率（酶在连接反应中的连接效率（20倍）倍）HOPHOPHOP535353RNA连接酶活性连接酶活性第七节第七节核核酸酸末末端端修修饰饰酶酶一一.细菌碱性

50、磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）1.特点特点1)除去除去ss-DNA，ds-DNA和和RNA分子两端的分子两端的3-和和5-磷酸基磷酸基2)对热稳定对热稳定2.用途用途1)载体载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率重组频率2)核酸末端标记核酸末端标记二二.牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（CIP）与与BAP相同，只是相同，只是CIP对热敏感对热敏感-32PATPATP5POH3532POH33HOP53HO32P5III5POH35HOOH35POH33HOP53HOOH53HOP5磷酸酶磷酸酶(I)与磷酸激酶与磷酸激酶(II)活性活性磷酸激酶的交换