2022年分子生物学第九章分子生物学研究方法电子教案 .pdf

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1、第九章分子生物学研究方法1课程教学内容(1)核酸技术 1基本操作(2)核酸技术 2克隆技术(3)核酸技术 3测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。本章内容?核酸的凝胶电泳?DNA 分子的酶切割?核酸的分子杂交?基因扩增?基因的克隆和表达?细菌的转化?DNA 核苷酸序列分析?蛋白质的分离与纯化?研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放

2、置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这个意义上讲，DNA 和 RNA 的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。分子量较小的 DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型

3、，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA 分子或线性 DNA分子要快些。Gel matrix(胶支持物)is an inserted,jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose(琼脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb DNA can be visualized by

4、staining the gel with fluorescent dyes,such as ethidium bromide(EB 溴化乙锭)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability,and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range(1 to a few hundred bp).Pulse

5、d-field gel electrophoresis(脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally(直角地)to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight,as well as to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and u

6、p to several Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases(限制性内切酶)cleave DNA molecules at particular sites Restriction endonucleases(RE)are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize(识别)short(4-8bp)t

7、arget sequences that are usually palindromic(回文结构),and cut(切割)at a defined sequence within those sequences.e.g.EcoRI The random occurrence of the hexameric(六核苷酸的)sequence:1/4096 (4-6=1/46)文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G1

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14、10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity:target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized,

15、and thus the frequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate:blunt/flush ends(平末端),sticky/staggered ends(粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA 或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么

16、如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA 或 RNA 分子，都是在杂交之前，通过毛细血管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去。常用的滤膜有尼龙膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸和二乙氨基乙基纤维素滤膜核酸杂交通常包括两个步骤：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移第二，将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA 或 RNA探针进行杂交。Southern Blotting：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记

17、的单链DNA 或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的DNA 片段，这种实验方法叫做DNA 印迹杂交技术。是由E.Southern 于 1975年首先设计出来的，故又叫做 Southern DNA 印迹技术。Northern Blotting 1979年，J.C.Alwine 等人发展出的一种用于RNA 杂交的新方法。将电泳凝胶中的RNA 转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起。称为Northern Blotting 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白的抗体反应，这种技术叫做Western Blotti

18、ng.定义：将 RNA 分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E

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24、9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10

25、S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5斑点印迹杂交（dot Blotting）：基本原理和操作步骤是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后同Southern 印迹一样的方式同核酸探针分子杂交。菌落（噬菌斑）杂交：1975 年，Mgrunstein 和 D Hogness根据检测重组体DNA 分子的核酸杂交技术原理，对 Southern 吸引技术做了一些修改，发展出了一种杂交技术。在 1977 年，W.D.Benton 和 R.W.Davis 又发展出了与此类似的筛选含有克隆DNA 噬菌体的杂交技术。菌落杂交或噬菌斑杂交有时也叫做原位杂交，因为生长

26、在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA 变性和杂交。四、基因扩增基因扩增的五个方面的内容：第一，在体外应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）技术和合成的寡核苷酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。第二，通过体外 DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上，并转化到适当的寄主细胞，于是在体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。第三，在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因的产生和明显的扩增。第四，程序基因扩增第五，在生物

27、的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关基因在基因组上聚集成簇。聚合酶链式反应：是美国Cetus 公司人类遗传研究室的科学家K B Mullis于 1983 年发明的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法。PCR 技术的基本原理：首先使双链的DNA 分子变性为单链DNA 分子然后 DNA聚合酶以单链 DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互补链。DNA 聚合酶需要有一小段双链DNA 来启动新链的合成。因此新合成的DNA 链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA 链两端的退火决定的。在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条

28、单链都可以作为合成新生互补链的模板。在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新旧链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA合成和链的分离。文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T

29、2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8

30、T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G

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34、W4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5

35、ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5PCR 反应的最后结果是，经过几次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA 分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的拷贝数2n.PCR 技术的两个特点：第一，能够知道特定DNA 序列的合成；第二，特定的DNA 区段得到了迅速大量的扩增。例如，经过30 次循环，便可使靶DNA 得到 109 倍的扩增。PCR 反应及多次重复进行的温度周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤：首先是将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温环境加热 1 分钟

36、，使双链 DNA发生变性，分离出单链的模板DNA；然后降低反应温度使专门设计的一对寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用，结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，将反应混合物的温度上升到72 度左右保温 1.5 分钟,这时在 DNA 聚合酶的作用下，链得到延伸。寡核苷酸引物：引物长度：通常在15-30mers 简并引物：是一类由寡核苷酸组成的混合物，彼此仅有一个或几个核苷酸的差异。嵌套引物Taq DNA聚合酶：Klenow 片段热敏感，易失活；反应温度低，出现错配碱基；1986年，从 75 度的热泉中的细菌中分离纯化出Taq酶。与大肠杆菌 DNA 聚合酶相比，Taq 酶使PCR 的

37、特异性和敏感性高PCR 技术的应用：基因组克隆、反向PCR 和染色体步移、不对称 PCR 与 DNA 序列测定、RT-PCR 与 RNA 分析、基因的体外诱变、基因组的比较研究五、基因的克隆和表达Processes(过程)of DNA cloning：1）Form the recombinant DNA molecules(重组 DNA)by inserting your interested DNA fragments into a proper vector(载体).(Require restriction enzymes and ligase)2）Transform(转化)the rec

38、ombinant DNA molecules into competent cells(感受态细胞).3）Propagation of the cells containing the recombinant DNA to form a clone(克隆),a set of identical cells containing the same recombinant DNA.4）Select the desired clones using the selective marker.5）Host organisms/cells（宿主）:where the plasmids get multi

39、plied and propagated faithfully,which is crucial for DNA cloning.-Prokaryotic host(原核宿主):E.coli(most cases)文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH1

40、0S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH

41、10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 H

42、H10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4

43、HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4

44、 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T

45、4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10

46、T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5文档编码:CR7J7P7U10T4 HH10S9G10E9J5 ZW4G8T2F3J5-Eukaryotic host（真核宿主）:Yeast Saccharomyces cerevisiae(large fragments of human genome)General features of a Vector（作为载体的一般特征）：1）They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of host s geno

47、me.2）Easily to be isolated from the host cell.Most are circular,some are linear(e.g.YAC vector).3）Contains at least one selective marker,which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not.4）Contains a multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for

48、 DNA manipulation.Cloning vectors(克隆载体):allowing the exogenous DNA to be inserted,stored,and manipulated at DNA level.E.coli cloning vector(circular):plasmids(质粒)、bacteriophages(l and M13)(噬菌体)、plasmid-bacteriophage l hybrids(cosmids)(考斯质粒质粒和噬菌体杂和体)。Yeast cloning vector:yeast artificial chromosomes(

49、YACs，酵母人工染色体)(Linear)。Plasmids:small,extrachromosomal circular molecules,from 2 to 200 kb in size,which exist in multiple copies within the host cells.Contain an origin of replication（复制起点）,at least one selective marker（选择标记）and multiple cloning site（多克隆位点）.Example of selective marker:ampr gene enco

50、ding the enzyme b-lactamse which degrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨苄）The commonly used plasmid are small in size(3 kb)Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNA library)：A DNA library(DNA文库)is a population of identical vectors that each contains