2022年过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 过氧化物酶（ POD）活性测定【试验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中,在有H202存在条件下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色的 4- 邻甲氧基苯酚,可用分光光度计测生成物的含量来测定活性；【试验试剂】愈创木酚、 30%过氧化氢、 20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（ pH6.0）、反应混合液 100mmol/L磷酸缓冲液（ Ph6.0 ）50mL,加入愈创木酚 28uL, 加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液溶解冷却后,加入 30%过氧化氢 19uL,混合匀称储存在冰箱中 【方法步骤】（1）、粗酶液

2、的提取称取小麦叶片0.25g ,加 20mmol/LKH2PO4 2.5mL,于研钵中研成匀浆,以4000r/min离心 10分钟,收集上清液储存在冷处,所得残渣再用 提取液 酶活性过高,稀释 10 倍 ；20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次,全并两次上清液,所得的即为粗酶（2）、酶活性的测定 取试管 3 只,于一只中加入反应混合液 3mL,KH2PO41mL,作为校零对比,另外三只中加入反应混合液 3mL,稀释后的酶液 1mL（如表 1）,立刻开启秒表,于分光光度计 470nm波长下测量 OD值,每隔 1min 读数一次（ 4min）；以每分钟表示酶活性大小,将每分钟OD值增加

3、 0.01 定义为一个活力单位；表 1 紫外吸取法测定POD酶活性配置表 g （鲜重） 表示之；也可以用每 min 管号S0（对比）S1（试验）S2（试验）反应混合液 ml 3.0 3.0 3.0 KH2PO4 ml 1.0 0.0 0.0 酶液 ml 0.0 1.0 1.0 4.结果运算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 A 470 /min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示；A470V T0.01VtFWPOD总活性 u/gFW= 式中： POD总活性以酶单位每克鲜重表示；其中 470=ACK-AE 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK

4、照光对比管的吸光度；AE 样品管的吸光度；名师归纳总结 Vt 样品液总体积,mL；第 1 页,共 4 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - V1 测定时样品用量,mL；W样品鲜重,g；蛋白质含量单位为 mg/g；过氧化氢酶的活性测定紫外吸取法【原理】H2O2 在 240nm 波长下有剧烈吸取,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度 A240 随反应时间而降低；依据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性；【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液：取A 液 91.5ml ,B 液 8.5ml, 充分混合；取 0.52ml 30%的过氧化氢稀释

5、到50ml. 0.1mol/L H2O2以 30%的过氧化氢稀释30*1.1g/34.01mol/100ml=9.7mol/L,【方法】 1. 酶液提取：称取新奇小麦叶片或其它植物组织 0.5g 置研钵中,加入 2ml 4 下预冷的 pH7.8 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,再用缓冲液冲洗研钵数次定容至 25ml,合并冲洗液, 混合匀称后置于 5冰箱中静置 10min,取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液,5下储存备用；2. 测定：取 10ml 试管 3 支,其中 2 支为样品测定管,1 支为空白管,按表 2 次序加入试剂；表 2 紫外吸取法测定

6、 H2O2 样品液配置表管 号 S0（对比）S1（试验）S2（试验）粗酶液 ml 0.2 （煮死）0.2 0.2 pH7.8 磷酸 ml 1.5 1.5 1.5 蒸馏水 ml 1.0 1.0 1.0 煮死酶在沸水浴中煮沸 5min. 30 预热后 , 逐管加入 0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2,每加完一管立刻记时,并快速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔 1min 读数 1 次,共测 4min ,待 3 支管全部测定完后,按下式运算酶活性； 3. 结果运算：以 1min 内 A240 削减 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ u）；A 240VT 470=ACK-AE 过

7、氧化氢酶活性u/gFW/min=0. 1V1tFW式中： POD总活性以酶单位每克鲜重表示；其中比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK 照光对比管的吸光度；AE 样品管的吸光度；名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - Vt 样品液总体积,mL；V1 测定时样品用量,mL；W样品鲜重,g；蛋白质含量单位为 mg/g；所需试剂的配制A 液： 0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g 定容至 1000ml B 液： 0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g 定容至 1000ml 1、超氧化

8、物歧化酶 SOD 活性测定0.05mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8取 A液 228.75ml , B液 21.25ml 定容至 1000mL ；130mmol/L 甲硫氨酸 Met 溶液：称取 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至 100mL 750u mol/L 氮蓝四唑溶液：称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100mL,用前配避光100u mol/L EDTA-Na2 溶液：称取 0.03721g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000mL ；用前配置,避光储存；20u mol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml ,用前配

9、置,避光2、过氧化物酶 POD 活性测定愈创木酚、 30%过氧化氢、名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 100m mol/L 磷酸缓冲液（ pH6.0）：分别取贮备液A： 0.2 mol/L Na 2HPO 4 6.15mL 溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH 2PO 4 溶液 43.85mL 充分混匀定容至 100mL ；20m mol/L KH2PO4 ：称取 0.681g KH2PO4 定容至 250mL. 3、过氧化氢酶 CAT 活性测定0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液 ,取 A 液 91.5ml ,B 液 8.5ml, 充分混合；0.1mol/L H2O2 以 30% 的过氧化氢配制：30% 的过氧化氢密度为1.1g/ 立方厘米 ,分子量为 34.01, 据理推算 : 30*1.1g/34.01mol/100ml=9.7mol/L30% PEG6000 配置方法如下：称取 300gPEG ,溶于肯定量的水中,最终定容之 1000ml ,即为所需的 30%PEG的溶液；感谢大家下载 ,本文档下载后可依据实际情形进行编辑修改 .再次感谢大家下载 .飞翔在学问的海洋吧 . 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页