2022年高致病性禽流感防治技术标准.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 高致病性禽流感防治技术规范高致病性禽流感（ Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）,是由正粘病毒科流感病毒属 A 型流感病毒引起的禽类烈性传染病；世界动物卫生组织（ OI E ） 将 其 列 为 A 类 动 物 疫 病 , 我 国 将 其 列 为 一 类 动 物 疫 病 ；疫法为预防、掌握和毁灭高致病性禽流感,依据中华人民共和国动物防；及有关的法律法规,特制定本规范施1适用范围本规范规定了高致病性禽流感的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措；、控制和净化标准本规范适用于中华人民共和国境内的一切从事禽类饲养、

2、经营和禽类产 品 生 产 、 经 营 , 以 及 从 事 动 物 防 疫 活 动 的 单 位 和 个 人 ；2 诊 断2 . 1 有 下 列 情 况 之 一 的 , 可 确 认 为 高 致 病 性 禽 流 感 ：2.1.1 有典型的临床症状和病理变化,发病急、死亡率高,且能排除鸡 新 城 疫 和 中 毒 性 疾 病,血 清 学 检 测 阳 性；2.1.2 未经免疫鸡场的家禽显现 H5、 H7 亚型禽流感血清学阳性；2.1.3 在禽群中分别到 H5、H7亚型禽流感病毒株或其它亚型高致病力禽 流 感 毒 株；2 . 2 流 行 特 点鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸽、孔雀等多种禽类均

3、易 感；传染源主要为病禽和带毒禽（包括水禽和飞禽）；病毒可长期在污染的 粪 便、水 等 环 境 中 存 活；病毒的传播主要通过接触感染禽及其分泌物和排泄物、污染的饲料、水、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介,经呼吸道、消化道感染,也可通过气源性媒介传播；2.3临床症状埋伏期从几小时到数天,最长可达21 天；表现为突然死亡、高死亡率,饲料和饮水消耗量及产蛋量急剧下降,病鸡极度沉郁,头部和脸部水肿,鸡冠发绀、脚鳞出血和神经紊乱；鸭鹅等水禽有明显神经和腹泻症状,可显现角 膜 炎 症,甚 至 失 明；2 . 4 病 理 变 化2.4.1 剖检病变 : 全身组织器官严峻出血；腺胃粘液增多,刮开可见

4、腺胃乳头出血、腺胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；消化道粘膜,特殊是十二指肠广泛出血；呼吸道粘膜可见充血、出血；心冠脂肪及心内膜出血；输卵管的中部可见乳白色分泌物或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂 , 有的可见“ 卵黄性腹膜炎” ；水禽在心内膜仍可见灰白色条状坏死；胰脏沿长轴常有淡黄色斑点和暗红色区域；2.4.2 急性死亡病例有时未见明显病变；病理组织学变化 : 主要表现为脑、皮肤及内脏器官（肝、脾、胰、肺、肾）的出血、充血和坏死；脑的病变包括坏死灶、血管四周淋巴细胞管套、神经胶质灶、血管增生和神经元性变化；胰腺和心肌组织局灶性坏死；名师归纳总结 22.55实验室诊断第 1 页,共 9 页.

5、1病原鉴定- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 2.5.1.1 符合相应生物安全级别的 , 且经国务院畜牧兽医行政治理部门认定的省级以上动物疫病诊断试验室和讨论机构的试验室 , 可开展病原鉴定工作；2 . 5 . 1 . 2 样 品 采 集活禽样品应采集泄殖腔拭子和气管拭子；死禽样品应采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织器官；小珍禽样品应采集新奇粪便（见附件一）；2 . 5 . 1 . 3 病 原 学 诊 断主要包括病原分别、鉴定（见附件二）和毒力测定 见附件三 ；2 . 5 . 2 血 清 学 诊 断主要包括琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）（不适用于水禽）

6、（见附件四）、血 凝 抑 制 实 验（H I）（见 附 件 五）；3 疫 情 报 告3.1 任何单位和个人发觉患有本病或疑似本病的禽类,都应当立刻向当 地 动 物 防 疫 监 督 机 构 报 告；3.2 动物防疫监督机构接到疫情报告后,按农业部动物疫情报告管理 办 法 和 国 家 高 致 病 性 禽 流 感 防 治 应 急 预 案 等 有 关 规 定 执 行 ；4 疫 情 处 理实 行 以 紧 急 扑 杀 为 主 的 综 合 性 防 治 措 施；4.1 发觉疑似高致病性禽流感疫情时,畜主应立刻将病禽（场）隔离,并限制其移动；动物防疫监督机构要准时派员到现场进行调查核实,进行流行病学调查、临床症

7、状检查、病懂得剖、采集病料、试验室诊断等,依据诊断区结果采取相应措施；4 . 2当 发 生 高 致 病 性 禽 流 感 时 , 按 下 列 要 求 处 理 ：4 .2 .1划定 疫 点、疫 区、 受 威胁 区由所在地县级以上畜牧兽医行政治理部门划定疫点、疫区、受威逼；疫点：指患病动物所在的地点；一般是指患病禽类所在的禽场（户）或 其 它 有 关 屠 宰 、 经 营 单 位 ； 如 为 农 村 散 养 , 应 将 自 然 村 划 为 疫 点 ；疫区：指以疫点为中心,半径 3-5 公里范畴内区域；疫区划分时,应注 意 考 虑 当 地 的 饲 养 环 境 和 天 然 屏 障 （ 如 河 流 、 山

8、脉 等 ） ；受 威 胁 区 ： 指 疫 区 外 延 5 - 3 0 公 里 范 围 内 的 区 域 ；4 . 2 . 2 封 锁由县级以上畜牧兽医行政治理部门报请同级人民政府打算对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后,应在 封 锁24 小时内发布封锁令,并对疫区进行；疫点对 疫 点 、 疫 区 采 取 不 同 的 处 理 措 施 ； 其 中 ：出入口必需有消毒设施；严禁人、禽、车辆进出和禽类产品及可能受污染的物品运出,在特殊情形下必需出入时,须经所在地动物防疫监督机构批准,经严格消毒后,方可出入；疫区交通要道建立动物防疫监督检查站,派专人监视动物和动物产品的流淌,对进出人员、车辆须进行消毒

9、；停止疫区内禽类及其产品的交易、 移 动 ；水禽 必 须圈 养 ,或在 指 定 地点 放 养 ；4.2.3扑杀确认为高致病性禽流感时,在动物防疫监督机构的监督指导下对疫点名师归纳总结 内所有的.禽2只4进行害扑化杀；第 2 页,共 9 页4.无处理- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 对全部病死禽、被扑杀禽及其禽类产品（包括禽肉、蛋、精液、羽、绒、内脏、骨、血等）依据 GB 16548畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程执行；对于禽类排泄物和被污染或可能被污染的垫料、饲料等物品均需进行无害化处理；禽类尸体需要运输时,应使用防漏容器,须有明显标志,并在动物防疫

10、的监督机构的监督下实施；种4.2.5紧急免疫对疫区和受威逼区内的全部易感禽类进行紧急免疫接种,登记免疫接禽群及其养禽场户,建立免疫档案；底4.2.6消毒对疫点内禽舍、场地以及全部运载工具、饮水用具等必需进行严格彻地消毒（见附件六）；4.2.7紧急监测对疫 区、 受威 胁区 内 禽类 实 施紧急疫情监测 ,把握疫情动态；4.2.8疫源分析与追踪调查依据流行病学调查结果,分析疫源及其可能扩散、流行的情形；对仍可能存在的传染源,以及在疫情埋伏期和发病期间售出的禽类及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应立刻开展追踪调查,一经查明立刻按照 GB 16548-1996畜禽病害肉尸及其产品无害化

11、处理规程实行就地销毁等无 害 化 处 理 措 施；4 . 2 . 9 封 锁 令 的 解 除疫点内全部禽类及其产品按规定处理后,在动物防疫监督机构的监督指导下,对有关场所和物品进行完全消毒；最终一只禽只扑杀 21 天后,经动物防疫监督机构审验合格后,由当地畜牧兽医行政治理部门向原发布封锁令的同级 人 民 政 府 申 请 发 布 解 除 封 锁 令；疫区解除封锁后,要连续对该区域进行疫情监测,6 个月后如未发觉新的病例,即 可 宣 布 该 次 疫 情 被 扑 灭；4 . 2 . 1 0 处 理 记 录对 处 理 疫 情 的 全 过 程 必 须 做 好 完 整 的 详 细 记 录 , 以 备 检

12、查 ；5 预 防 与 控 制5 . 1 加 强 饲 养 管 理 , 提 高 环 境 控 制 水 平 ；饲养、生产、经营场所必需符合动物防疫条件,取得动物防疫合格证；饲养场实行全进全出饲养方式,掌握人员出入,严格执行清洁和消毒程序 不 的（；鸡和水禽禁止混养,养鸡场与水禽饲养场应相互间隔3 公里以上,且得共用同一水源；养禽场要有良好的防止禽鸟（包括水禽）进入饲养区的设施,并有健全灭鼠设施和措施；5 .2加强消毒,做好基础防疫工作各饲养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格的卫生消毒）管理制度；5.3监测5 . 3 . 1由 县 级 以 上 动 物 防 疫 监 督 机 构 组 织 实 施

13、 ；5.3.2监测方法未经免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主（包括琼脂扩散实验、血凝抑制试验等方法）,结合病原分别和毒型鉴定、毒力鉴定进行监测；名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 9 页精选学习资料 - - - - - - - - - 鹧鸪免 疫 区 域 ： 以 病 原 学 监 测 为 主 , 结 合 血 清 学 监 测 ；5.3.3 监测对象：以鸡、火鸡、鸭、鹅等为主,也包括鹌鹑、雉鸡、鸵鸟、鸽、孔雀和候鸟等易感禽类；5.3.4监测环节与措施5.3.4.1 产地监测：对未免疫和免疫的养禽场均可采纳病原学监测方法 进 行 监 测；对全部原种、曾祖代、祖代和父母代养禽场

14、,有出口任务的养禽场,商 品 代 养 禽 场 每 年 要 进 行 两 次 监 测 ； 散 养 禽 不 定 期 抽 检 ；采样比例：每群采 10 只禽的棉拭子,放在同一容器内,混合为一个样品,用于鸡 胚 接 种,进 行 病 毒 分 离；对 于 未 免 疫 的 养 禽 场 以 血 清 学 监 测 为 主 ；有出口任务养禽场的监测 , 每批次依据 0.5%的比例采样；每批次数量超过 10 万只的,按 0.1%的比例采样；其它全部养禽场每半年至少监测一次；父母代以上种禽场,每批次（群）依据 0.5%的比例进行监测；商品代养禽场,每批次（群）依据 0.1%的比例进行监测；散养禽不定期抽检；每批次（群）监

15、测 数 量 不 得 少 于 2 0 份；5 . 3 . 4 . 2 流 通 环 节 的 监 测对交易市场、禽类屠宰厂（场）、异地调入的活禽和禽产品进行不定期 的 病 原 学 和 血 清 学 监 测；5 . 3 . 5 监 测 结 果 处 理监测结果要准时汇总,由省级动物防疫监督机构定期上报全国畜牧兽医总站；发觉病原学和非免疫禽血清学阳性的,要依据农业部动物疫情报告治理方法的有关规定立刻报告和处理；监测中发觉因使用未经农业部批准生名师归纳总结 产的禽流感疫苗而造 成血清 学 阳性禽 群 ,一律按发生禽 流感疫情处理；第 4 页,共 9 页5.3.6免疫在发生疫情时,对疫区、受威逼区内的全部易感禽

16、只进行紧急免疫；在曾发生过疫情区域的水禽, 必要时也可进行免疫；所用疫苗必需是经农业部批准使用的禽流感疫苗；5.3.7引种检疫国内异地引入种禽及精液、种蛋时,应当先到当地动物防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格；引入的种禽必需隔离饲养21 天以上,并由动物防疫监督机构进行检测,合格后方可混群饲养；从国外引入种禽及精液、种蛋时,按国家有关规定执行；6无高致病性禽流感区标准无 高 致 病 性 禽 流 感 区 , 必 须 满 足 以 下 条 件 ：6 .1达 到 国 家 无 规 定 疫病 区 基 本 条 件 ；6 .2有 定 期 、 快 速 的 动 物 疫 情 报 告 记 录 ；6.3 在过去 3

17、 年内没有发生过高致病性禽流感；在过去6 个月内,没有接种过禽流感疫苗；停止免疫接种后,没有引进接种过禽流感疫苗的禽类；6.4 有有效的监测体系和监测区,过去3 年内实施疫病监测,未检出H 5 、 H 7病 原 或H 5 、 H 7禽 流 感H I实 验 阴 性 ；6. 5所 有 的 报 告 、 监 测 记 录 等 有 关 材 料 准 确 、 详 实 、 齐 全 ；6.6 如发生高致病性禽流感时,在实行扑杀措施及血清学监测的情形下,最终一只病禽扑杀后6 个月；或实行扑杀措施、血清学监测及紧急免疫情况下,最终一只免疫禽屠宰后6 个月,经实施有效的疫情监测和血清学检测确认后,方可重新申请无高致病性

18、禽流感区；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 附件一：样品采集与处理活禽病料应包括气管和泄殖腔拭子,最好是采集气管拭子；小珍禽用名师归纳总结 拭子取样易造成损耗,可采集新奇粪便；死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑第 5 页,共 9 页等组织样品；将每群采集的10 份棉拭子,放在同一容器内,混合为一个样品；容器中放有含有抗菌素的pH 值为 7.0-7.4的 PBS 液；抗生素的挑选视当地情况而定,组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU/mL）、链霉素（ 2mg/mL）,庆大霉素（ 50 g/mL）,制霉菌素（ 1000IU/mL）,但粪便和泄殖腔拭子

19、全部的抗生素浓度应提高5 倍；加入抗生素后pH 值应调至 7.0-7.4 ；如不加抗生素,可用细菌过滤器过滤除菌；粪便、研碎的组织用含抗生素的溶液配成10-20%（W/V）的悬液,冰浴放置1-2 小时内样品应尽快处理,如来不及处理,可放 在 - 7 0 或 以 下 保 存 , 如 放 在4 保 存 不 能 超 过5天 ；将混合样品用抗生素制成悬液, 接种到 9-11 日龄鸡胚尿囊腔内, 0.1mL胚；置于 35- 37孵育 4-7 天, 检测死胚和全部到孵化末期鸡胚尿囊液的血凝活性；用浓缩病毒和全部A 型流感病毒共有的核衣壳或基质抗原的抗血清作免疫扩散实验,能确诊A型流感病毒；测定毒株对禽的致

20、病力方法: 将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1：10 稀释,以 0.1mL羽的剂量翅静脉接种至少8 只 4-8 周龄的易感鸡；每日观看鸡的死亡情况,连续观看10 天；10 天内假如死亡率高于75%,就认为该病毒毒株为高致病力；附件二：病原鉴定方法增殖 A 型流感病毒的较好方法是将其接种于无特定病原体SPF）鸡胚；粪便和组织悬液经1000rp/m 离心 10 分钟,上清液以0.2mL/ 胚的剂量经尿囊腔途径接种 911 日龄 SPF鸡胚,每个样品接种5 个胚,于 37孵化箱内孵育 4-7 天； 18 小时后每 8 小时观看鸡胚死亡情形,死亡鸡胚或者濒死鸡胚以及孵育末期全部的鸡胚放在4冷却,检测尿囊液的

21、HA活力（见附件4）；阳性反应说明很可能有正粘病毒科的流感病毒,呈阴性反应的尿囊液至少应再接种一批鸡胚；用 AGID试验（见附件5）检测流感病毒,可证明A 型流感病毒属全部成员共同存在的核衣壳和基质抗原；抗原制备方法：1 用浓缩的尿囊液病毒或者用已感染的绒毛尿囊膜的提取物,这些抗原用标准血清进行标定；将含毒尿囊液以超速离心或者在酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒；酸性沉淀法是将1.0mol/L HCl加入到含毒尿囊液中,调pH 值到 4.0,将混合物置于冰浴中作用1 小时,经 1000rp/m,4离心 10 分钟,弃去上清液；病毒沉淀物悬于甘氨- 肌氨酸缓冲液中（含1%十二烷酰肌氨酸缓冲液,用 0.

22、5 mol/L甘氨酸调pH 值至 9.0 ）；沉淀物中含有核衣壳和基质多肽；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 2 用含丰富病毒核衣壳的尿囊膜制备；从尿囊液呈 HA阳性的感染鸡胚中提取绒毛尿囊膜,将其匀浆或研碎,然后反复冻融三次,经 1000rp/m 离心 10 分 钟 , 弃 沉 淀 , 取 上 清 液 用 0 . 1 %福 尔 马 林 处 理 , 制 备 抗 原 ；附 件 三：静 脉 接 种 致 病 指 数（I V P I）实 验 操 作 方 法收成接种病毒的 SPF 鸡胚的感染性尿囊液,测定其血凝价大于 1/16（24 或 lg24 ）,将含毒尿囊

23、液用灭菌生理盐水稀释 10 倍（切忌使用抗生素 ） , 将 此 稀 释 病 毒 液 以 0 . 1 mL / 羽 静 脉 接 种 1 0 只 6 周龄 SPF鸡,2 只同样鸡只接种 0.1mL 稀释液作对比（对比鸡不应发病,也不计入试验鸡）；每隔 24 小时检查鸡群一次,共观看 10 天；依据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为 0,病鸡记为 1,重病鸡记为 2,死鸡记为 3（病鸡和重病鸡的判定主要依据临床症状表现；一般而言,“ 病鸡” 表现有下述一种症状,而“ 重病鸡” 就表现下述多个症状,如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和 / 或肉髯发绀、脸和 / 或头部肿胀、神经症状；死亡鸡在其死

24、后的每次观察 都 记 为 3）；IVPI 值每只鸡在 10 天内全部数字之和 / （10 只鸡 10 天）,如指数为 3.00 ,说明全部鸡 24 小时内死亡；指数为鸡 表 现 临 床0.00 ,说明 10 天观看期内没有症 状；V脂当 IVPI值大于1.2时,判定分别株为高致病力禽流感病毒（DHPAI）；附件免疫四：）琼凝胶扩散实验（AGI由于 A 型流感病毒都有抗原性相像的核衣壳和基质抗原,可以利用免名师归纳总结 疫扩散试验检测A 型流感病毒的存在与否；制备的浓缩病毒制剂含有基质和核第 6 页,共 9 页衣壳抗原；基质抗原与核衣壳抗原相比扩散得较快；琼脂免疫扩散试验已作为常规试验方法来检测

25、 鸡与火 鸡 的特异 性 抗体,并可作为 鸡群感染证据；1抗原制备一般常用的核衣壳浓缩制剂是从被感染的10 日龄鸡胚绒毛尿囊膜中获得的,将其匀浆冻融三次,以1000rp/m 离心 10 分钟,取上清液加0.1%福尔马林或 1% - 丙内酯灭活,再离心即可作为抗原；流感病毒感染后不是全部的禽种都能产生沉淀抗体；2琼脂板制备该试验常用 1 克优质琼脂粉或0.8-1克 琼脂糖加入 100mL 0.01mol/L、pH 值 7.2的 8%氯化钠 - 磷酸缓冲液中,水浴加热融解,稍凉（60-65）,倒入琼脂板内（厚度为3mm）,待琼脂凝固后, 4冰箱储存备用；用打孔器在琼脂板上按7 孔梅花图案打孔,孔径

26、约3 mm -4mm,孔距为3mm；3加样用移液器滴加抗原于中间孔,四周1、4 孔加阳性血清,其余孔加被检血清,每孔均以加满不溢出为度,每加一个样品应换一个滴头, 并设阴性对比血清；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 4感作 定将琼脂板加盖保湿,置于37温箱； 24-48小时后,判定结果；5结果判5.1 阳性； CX 阳性血清与抗原孔之间有明显沉淀线时,被检血清与 抗原孔之间也形成沉淀线,并与阳性血清的沉淀线末端吻合,就被检血清判为名师归纳总结 阳性；第 7 页,共 9 页5.2 弱阳性；被检血清与抗原孔之间没有沉淀线,但阳性血清的沉淀线 末 端 向 被

27、 检 血 清 孔 偏 弯 , 此 被 检 血 清 判 为 弱 阳 性 （ 需 重 复 实 验 ） ；5.3 阴性；被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线,且阳性血清沉淀线直向被检血清孔,就被检血清判为阴性；附件五：血凝抑制（HI）实验1操作程序1.1抗原血凝效价测定1 .1 .11 0 % 和0 .5 %鸡 红 细 胞 液 的 制 备1.1.1.1 采鸡血：用注射器吸取阿氏液约1mL,取 3 日龄-10 日龄 SPF鸡（最少 2 只）,心脏采血约2mL-4mL,与阿氏液混合,放入装10mL阿氏液的离心管中混匀；1.1.1.2 洗涤鸡红细胞：将离心管中的血液经1500rp/m-1800 rp/m 离心

28、 8 分钟,弃上清液,沉淀物加入阿氏液,轻轻混合,再经1500rp/m-1800rp/m 离心 8 分钟,用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜,再多次重复以上过程后,加入阿氏液20 mL,轻轻混合成红细胞悬液,4储存 5 天备用；1.1.1.3 10% 鸡红细胞悬液：取阿氏液储存不超过5 天的红细胞,在锥行刻度离心管中离心1500rp/m-1800rp/m 8分钟,弃去上清液,精确观看刻度离心管中红细胞体积 mL,加入 9 倍体积 mL的生理盐水,用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀；1.1.1.4 0.5% 鸡红细胞液：取混合匀称的10%鸡红细胞悬液1 mL,加入19mL生理盐水

29、,混合均匀即可；1.1.2抗原血凝效价测定1.1.2.1 于微量血凝板的A-G 排各孔分别加入生理盐水50 L；1.1.2.2 A-G排每排的第 1 孔加入抗原 50 L,每一种抗原的血凝效价测定应作两排检验,如A1 孔与 B1 孔各加入新城疫病毒抗原50 L；C1 孔与 D1孔 各 加 入 禽 流 感 病 毒 （ A型 ） 抗 原5 0 L , 以 此 类 推 ；1.1.2.3 用微量移液器从第1 孔至第 12 孔对抗原作系列倍比稀释,即将第 1 孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3 次,吸出 50 L 移至第 2 孔,用生理盐水清洗吸头3 次后,再用于下一个孔的混合,以此类推,直至第12孔

30、,从第12 孔吸出50 L 弃去,此孔抗原的最终稀释度为1:4096；1.1.2.4 每孔中加入0.5%鸡红细胞悬液50 L,包括H11 孔与 H12孔；1 . 1 . 2 . 5将 血 凝 板 置 振 荡 器 上 中 速 振 荡1 - 2分 钟 ；1 . 1 . 2 . 6置 室 温 （ 1 8 - 2 2 ） 感 作4 5分 钟 ；1.1.2.7 抗原血凝价判定：感作完毕,观看血凝板,判读结果（见表- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 1）；能使红细胞完全凝集（100%凝集, +）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价,此效价为 1 个血凝单位；留意对比孔

31、应出现完全不凝集（- ）,否就 此 次 检 验 无 效；1 . 2 血 凝 抑 制 实 验1 . 2 . 1 被 检 血 清 样 品 准 备1.2.1.1 血清灭活：被检血清,包括阳性、阴性血清,56水浴 30-45 分 钟,以 破 坏 补 体 及 血 凝 抑 制 因 子；1 . 2 . 2 抗 原 准 备禽流感病毒（ A 型）作血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位是 8 个与 4 个血凝 单 位；8 个血凝单位抗原的配置：假如某抗原的血凝效价为 1：1024,8 个血凝单位为 1024/8=128（即 1：128）,取生理盐水 11.8mL,加入 1：10 稀释的抗 原 1 . 0 m L ,

32、 混 合 均 匀 即 为 1 ： 1 2 8 稀 释 液 ；1 . 2 . 3 抗 原 血 凝 效 价 的 重 测 定1.2.3.1 为了确保血凝抑制试验时使用抗原的活性,有必要对已配置的 8 个血凝单位抗原进行血凝效价的重测定,此项试验常与血凝抑制试验同时进行；1.2.3.2 A 至 H 各排第 1 孔分别加入 100 L8 个血凝单位抗原；1. 2. 3. 3 A- H 各 排 第 2 - 8 孔 分 别 加 入 生 理 盐 水 5 0 L ；1.2.3.4 将抗原分别作系列倍比稀释至第 8 孔,从第 8 孔吸出 50 L弃 去；1 . 2 . 3 . 5 每 孔 加 0 . 5 %鸡 红

33、 细 胞 悬 液 5 0 L ；1 . 2 . 3 . 6 将 血 凝 板 置 微 量 振 荡 器 振 荡 1 - 2 分 钟 ；1 . 2 . 3 . 7 室 温 （ 1 8 - 2 2 ） 感 作 4 5 分 钟 ；1.2.3.8 观看结果,如血凝单位偏离两个以上稀释度,就血凝抑制实验无效；如血凝单位偏离 1 个稀释度,属可校正范畴,按常规对被检血清的血凝 抑 制 效 价 进 行 校 正；1 . 2 . 4 血 凝 抑 制 实 验1.2.4.1 血凝板每排检测一份被检血清；第 1 孔分别加入被检血清 20 L , 再 加 入 生 理 盐 水 8 0 L , 被 检 血 清 稀 释 度 为

34、1 ： 5 ；1 . 2 . 4 . 2 设 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 对 照 ；1.2.4.3 每排第 2 孔分别加入 50 L8 个单位抗原,第 3-11 孔分别加入 5 0 L 4 个 单 位 抗 原；1.2.4.4 用移液器自第 1 孔吹吸 3 次后,取出 50 L 移至第 2 孔,以此 倍 比 稀 释 至 第 1 1 孔 , 从 1 1 孔 吸 出 5 0 L 弃 去 ；1.2.4.5 第 1 孔为血清对比,第 2 孔被检血清为 1：10 稀释,第 3 孔为 1 ： 2 0 , 第 4 孔 为 1 ： 4 0 , 以 此 类 推 , 第 1 1 孔 为 1 ： 5 1 20

35、 ；1 . 2 . 4 . 6 每 孔 加 入 0 . 5 %鸡 红 细 胞 悬 液 5 0 L ；1 . 2 . 4 . 7 将 血 凝 板 置 微 量 振 荡 器 上 振 荡 1 - 2 分 钟 ；1 . 2 . 4 . 8 置 室 温 （ 1 8 - 2 2 ） 感 作 4 5 分 钟 ；1.2.4.9 感作完毕,将血凝板倾斜 70 ,凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面对下呈线状流淌,出现与红细胞对比孔一样者为完全不凝集孔；显现完全不 凝 集 的 血 清 最 高 稀 释 度 为 该 被 检 血 清 血 凝 抑 制 效 价 ；名师归纳总结 2结果判定第 8 页,共 9 页禽流感（ A 型）的血凝

36、抑制效价 1:10为阳性；该试验中,鸡血清极少显现非特异性阳性反应,被检血清不必进行预处理；其它禽类血清可能对鸡- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 红细胞有非特异性凝集反应,可用鸡红细胞对被检血清进行吸附,以除去这种非特异性凝集特性；方法是在每 0.5mL 的被检血清中加入 0.025mL 的鸡红细胞,轻摇后静置 30 分钟以上, 1500rp/m 离心 25 分钟；也可用不具有特异性抗 体 的 被 检 禽 红 细 胞 代 替 鸡 红 细 胞；附 消备手等 洒件六：毒1药品种类烧 碱 、 醛 类 、 氧 化 剂 类 、 氯 制 剂 类 、 双 季 胺 盐

37、 类 等 ；2消毒范围禽舍地面及内外墙壁,舍外环境,饲养、饮水等用具,运输等设施设以 及 其 它一切 可 能被 污 染的场 所 和 设施 设 备 ；3消毒前的准备3. 1消 毒 前 必 须 清 除 有 机 物 、 污 物 、 粪 便 、 饲 料 、 垫 料 等 ；3 . 2消 毒 药 品 必 须 选 用 对 禽 流 感 病 毒 有 效 的 ；3.3 备有喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒防护器械（如口罩、套、防护靴等）、消毒容器等；4消毒方法4. 1金 属 设 施 设 备 的 消 毒 , 可 采 取 火 焰 、 薰 蒸 等 方 式 消 毒 ；4.2 禽舍、场地、车辆等,可采纳消毒液清洗、喷洒等

38、方式消毒；4.3 养禽场的饲料、垫料等,可实行积累发酵或焚烧等方式处理；4 . 4粪 便 等 可 采 取 堆 积 密 封 发 酵 或 焚 烧 等 方 式 处 理 ；4 .5饲 养 、 管 理 等 人 员 可 采 取 淋 浴 消 毒 ；4.6 衣、帽、鞋等可能被污染的物品,可实行消毒液浸泡、高压灭菌方式消毒；4.7 疫区范畴内办公、饲养人员的宿舍、公共食堂等场所,可采纳喷的方式消毒；4.8 屠宰加工、贮藏等场所以及区域内池塘等水域的消毒可实行相应的方式进行,防止造成污染；表 1： 血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果1 红细胞全部凝集,匀称铺于孔底,即100%红细胞凝集+ 2 红细胞凝集基本同上,但孔底有大圈+ 3 红细胞于孔底形成中等大的圈,四周有小凝块+ 4 红细胞于孔底形成小圆点,四周有少许凝集块+ 5 红细胞于孔底呈小圆点,边缘光滑整齐,即红细胞完- 全不凝集名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 9 页