最新微生物实验室质量控制PPT课件.ppt

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1、微生物实验室质量控制质量控制相关定义l质量控制：满足质量要求的操作技术和活动。l质量保证：为了满足实验室质量要求，制定相应的计划，实施证明（记录）所进行的一系列的系统活动l外部质量控制：通过互相校准和/或检验对实验室的操作和结果所进行的控制l内部质量控制：实验室内部采取的以对比分析、跟踪以及相关方法，对实验室工作的连续性控制计划。l质量手册：是描述质量系统元素的文件或文件的集合。设备控制和程序l微生物检验常用需监控的设备和仪器l1培养箱（生化培养箱或CO2培养箱等）、干燥箱、高压灭菌锅、净化工作台、pH计、冰箱，（低温冰箱或冷柜）温度计、紫外灯、显微镜、离心机、天平、。l2小计量容器l3微生物

2、测定仪器、微生物检定仪器、空气采样器、酶标仪专用等。温度计l实验室必须要有工作温度计和参照温度计。l工作温度计：用于日常温度检查。l参照温度计：用于校正工作的温度计。l温度计运行检查：一般可采用一次/半年的运行检查。l日常检查、校准检查、运行检查等都应做好相应的技术记录。培养箱、水浴箱和冰箱的温度控制l根据培养物性质及温度要求，培养箱应分别设置（以用途和温度分）l培养箱的温差要求，一般显示值与实测值相差不大于1，箱体内各点温差（内部的温度均衡性）以及温度波动同样不大于1。l温度监控方法：可将工作温度计置甘油中，放入待测箱体内，观察工作温度计的温度，最好1-2次/天监控记录，高压灭菌锅的温度控制

3、（一）l高压灭菌锅；生物指示菌法（常用）、化学变色纸片及高压灭菌锅温度计等方法进行检测。l生物指示菌法是一种高压灭菌锅的效果显示法。l高压灭菌锅由专人按作业指导书操作，并做好每一次的作业记录。l高压灭菌锅使用时，内置物品不能太多，单位体积内的内容物（每瓶内的培养基）不能太多。同时应注意内容物不同耐受温度。总的暴露时间最好不要超过45min。高压灭菌锅的温度控制（二）l高压灭菌锅日常工作记录应包含以下信息：高压灭菌的材料、开始时间、压力/温度、取出时间、高压灭菌胶带的颜色变化（日常常用无菌培养代替）l高压灭菌锅温度波动范围：110，115和1212。l高压灭菌锅校准周期一般在半年。干燥灭菌箱温度

4、控制l干燥灭菌箱日常工作记录中应包括以下信息：开始的时间、到达灭菌温度时的时间、取出的时间（或关闭时间）。l干燥灭菌箱的温度校准；用参考温度计进行温度测试。l干燥灭菌箱温度要求与精确度：1605或1805。前者为灭菌2h，后者为30min。l干燥灭菌箱校准时间一般为一年。培养基配制用蒸馏水的控制l对于蒸馏水器来说：按设备说明，定期清洁离子交换器和更换离子交换材料。l检测要求：西欧标准为微生物检验用蒸馏水的特定电导率0.5ms/m；细菌数50cfu/ml。我们日常用的标准为10ms/m，未见有细菌指标。l检测频率：1次/每月。l蒸馏水定点供应，并做好相应的质量控制，记录检测结果。天平的管理l天平

5、放置要求：无振动、无气流影响及水平台面上。l天平要有使用及运行检查记录。l天平作为计量仪器是列入国家强制检定的范围，一般1次/年进行检定。l运行检查频率按运行计划或按产品（天平生产厂家）给出的标准重量单位进行对照。容积的控制（一）l通过一定的控制方法，保证高压灭菌后的稀释剂满足标准用量。l采取称中法来测定蒸发量，体积100ml的稀释剂起重量为101g。高压够体积偏差不得超过1%。l采取先高压后定量分装，可避免因高压造成的体积误差。l对保存的定量液体应在使用时，注意补充容积。容积的控制（二）l吸管的控制：通过小计量容器校准，后使用。l小计量容器吸管、容量瓶、量筒等玻璃器皿，校准周期一般为1-2次

6、/一年。l小计量容器日常使用检查可每周进行一次，包括容器的完整性。并做好相应的记录。pH计lpH计使用前应用标准液进行校准。l缓冲液使用有效期：PH4.00约1年lPH7.00约6个月lpH9.00约6个月lpH计的维护：电极外表的定期清洗；l电极敏感性检测及极性恢复。净化工作台的控制l水平流净化工作台工作区域，要求洁净度为100级。空气沉降30min，细菌数1个/皿。垂直流净化工作台，细菌数0.49个/皿.l净化工作台运行检查频次：1次/月主要是细菌沉降检测。l净化工作台高效过滤膜一般为一年更换一次，并同时进行粒子与细菌沉降检测。紫外线灯的控制l检测方法：仪器测试法和生物测试法。前者是通过专

7、用仪器检测紫外灯管发射的紫外光强度。国家消毒技术规范中表明在距离照射无1米处，要求其强度为90。l生物测试法：采用一定的菌培养物，经一定比例稀释，菌量控制在200-250个/0.5ml，涂布平板在紫外灯光下照射，2min，同时设置普通光源的对照组，后置3748h，计算其杀灭率。要求杀灭率达99%。显微镜的控制l显微镜应制定作业指导书，日常维护记录及自校记录。l显微镜应置于无振动，避免灰尘，防潮等要求的环境。其它微生物检测专用仪器的控制l细菌鉴定仪、酶标仪等设备，工作中常用阳性对照检测其功能的正常性。l仪器的检定则按有关的部门检定或按自校作业指导书进行。l仪器的使用登记、校准计划、校准记录等文件

8、存档。l仪器专人使用、操作者应取得相应的岗位培训合格，持证上岗。培养基质量控制l正确进行培养基质量控制，并作为一项经常性的工作，建立完整的检验资料，是实验室今后通过相应级别的认证，在整个检验质量控制体系中所必须具备的文件资料。l现有的依据：卫生部1993年发布的食品检验用干燥培养基生产质量控制。但这个标准不完善。培养基的分类l按其成分分类按其成分分类：有天然培养基和合成培养基。l按按用用途途分分类类：基础培养基、增菌培养基、选择性培养基、鉴别培养基及厌氧培养基。按按培培养养基基的的形形态态分分类类：液体培养基、流体培养基、半固体培养基及固体培养基。l根根据据培培养养基基的的剂剂型型不不同同分分

9、类类：新鲜配制培养基和干燥培养基两种。检验中常用的培养基l水质检测用培养基：7种l化妆品检验用培养基：8种l食品检验用培养基：常用的有37种，110种被列入了GB4789中，其中生化试验培养基23种，一般和专用培养基89种。l食品、化妆品及涉水产品等产品微生物检验常规项目中所用的增菌分离培养基有所不同，对于菌种鉴定所用的培养基，各类产品分离的菌种其鉴定所用的培养基基本相同。l常用培养基的质量控制常用培养基的质量控制（一）l检检验验项项目目与与方方法法：对新批号的干燥培养基物理、化学及生物学指标鉴定lA：感官（外观）研细程度和颜色（溶解前后），透明度，杂质等；lB：PH测定，按各种培养基要求的P

10、H0.2，蒸馏水的PH应在6.4-7.0之间。lC：生物学指标检定，被检培养基相应细菌生长率测试；菌落大小及特征的检测。常用培养基的质量控制常用培养基的质量控制（二）l生生长长率率测测试试：适用与液体和固体培养基：将菌培养液，用生理盐水做倍比稀释，取合适稀释度进行平板计数或接种被检的培养基试管，同时以按相关的培养基国标配方新鲜配制的培养基进行对照。不低与10%。常用培养基的质量控制常用培养基的质量控制（三）l菌落大小测试：划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制的培养基无统计学差异。常用培养基检定用标准菌株常用培养基检定用标准菌株甲型副伤寒沙门菌50002伤寒沙门菌500

11、96乙型副伤寒沙门茵鸭沙门茵50083鼠伤寒沙门氏菌痢疾志贺菌1型5157Ol福氏志贺菌2 大肠埃希菌25922（ATCC）金黄色葡萄球菌25923（ATCC普通变形杆菌肺炎克雷伯菌肺炎亚种弗劳地枸橼酸杆菌4197l绿脓杆菌27853（ATCC）副溶血性弧菌常用培养基质量标准常用培养基质量标准l外观和理化标准：l干粉颜色：淡黄色粉末或呈现本培养基特有的颜色l溶解后培养基色泽：清晰透明（含琼脂除外）淡黄色或特有的色泽；l灭菌后的培养基PH：7.22为多；个别弧菌检验用培养基pH值偏高为：8.02l生物学指标：菌落特征及菌落大小。培养基保存环境培养基保存环境l制成的培养基保存环境为4冰箱，如制成平

12、板则用塑料袋包装置冰箱保存，l干燥培养基干粉含有活性物质、遇热易分解的物质应仔细查看存放条件，多数也须放在2-8条件保存。l有的培养基则以存放于10-15条件为易。如含有高浓度胆盐的培养基。养基制备控制程序养基制备控制程序l培养基配制所用的仪器设备培养基配制所用的仪器设备必须经过相应的鉴定。l配制培养基所用的用具及容器配制培养基所用的用具及容器必须是清洁或是灭菌的，一些特殊不易洗刷清洁的玻璃器皿，必要时可用重铬酸钾硫酸清洁浸泡后，取出置5%氢氧化钠溶液浸泡数分钟，再用3%盐酸溶液进行中和，然后用清水冲洗，烘干后备用。l培养基配制原料，试剂质量控制培养基的配制程序（一）l不同的培养基配制的程序有

13、所不同，但一般培养基配制程序主要有以下7个步骤、调配、融化、矫正pH、澄清过滤、分装、灭菌及鉴定。l注意点：配制时注意各类成分的用途。lpH测定干燥培养基在工厂生产时，对培养基PH进行了一定的调试，在实际工作中，由于配制的环境、配制所用的溶剂（蒸馏水）PH等条件有所不同，都会对所用的培养基PH要有所影响。因此对于干燥培养基配制，同样需要进行PH测验。培养基的配制程序（二）l配制好的培养基（尤其是糖发酵管）不宜久放。，因为培养培养基吸收空气中的二氧化碳，会使培养基变酸，从而影响细菌的生长。l培养基中的抑制剂及指示剂一定要精确称量，抑制剂要注意合理配伍。培养基主要原料的质量控制，l配制培养基的主要

14、原料有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、胆盐、无机盐和琼脂等，这些主要原料的有劣，直接影响到培养基的质量，由此也将影响检验质量。l指标有感官、理化、物理、生物学。培养基相关试剂的质量控制l培养基相关试剂的质量控制及阴、阳性对照菌株试验。对做生化反应的各类试剂，在配就后均应进行各项必要的鉴定。用已知阴、阳性菌株进行对照试验。对于其它如氧化酶、触酶、染色液等也同样需要经鉴定后用于试验。不合格培养基可能的原因（一）不合格培养基可能的原因（一）l干燥培养基结块干燥培养基结块ll培养基过于陈旧ll培养基处于潮湿环境中ll培养基生产时水分过高lPH偏离规定值偏离规定值ll培养基过于陈旧ll配制时所使用的蒸馏水非

15、中性ll培养基过度灭菌不合格培养基可能的原因（二）不合格培养基可能的原因（二）l培养基不清澈培养基不清澈ll使用了劣质水ll培养基PH值不对ll使用了不同的容器制备ll生产原料精度不够ll培养基过度灭菌l凝固温度过高凝固温度过高ll培养基干粉用的太多ll琼脂质量发生了变化不合格培养基可能的原因（三）不合格培养基可能的原因（三）l凝胶强度过低凝胶强度过低ll培养基干粉用的太少ll培养基未完全溶解ll培养基过度灭菌ll倾注前未振摇培养基瓶ll琼脂粉凝固强度较低l颜色不对颜色不对llPH不正确（带指示剂的培养基）ll培养基过度灭菌ll使用了不洁的容器制备不合格培养基可能的原因（四）不合格培养基可能的

16、原因（四）l培养基被污染培养基被污染ll培养基灭菌不彻底ll灭菌后存放不当而污染ll实验时使用了污染的器皿l生长不良生长不良ll可能由制备容器设备、水或样品带入抑制物ll样品中含有亚致死性损伤的微生物llPH不正确ll添加物（抑制剂）等浓度不当ll培养基过度灭菌ll实验时培养基或溶解样品时温度过高不合格培养基可能的原因（五）不合格培养基可能的原因（五）l过分生长过分生长ll培养基过度灭菌，选择性物质受到了破坏ll添加物浓度不当l菌落蔓延菌落蔓延ll琼脂表面过湿ll使用了过多的接种体积ll培养基过度灭菌l非典型生长非典型生长ll培养基制备不当ll干燥培养基存放陈旧ll制备成的培养基存放时间过长l

17、l生长条件不当（温度、时间、气体）检测质量保证检测质量保证l定期使用有证标准物质和次级标准物质（参考物质）进行内部质量控制。l实验室间的比对或能力验证l利用相同或不同方法进行重复检测l对留存的样品进行在检测。微生物检验质控方法微生物检验质控方法（一）l菌落计数精密度控制直接计数菌落计数精密度控制直接计数l选择同一标本，要求检验人员进行菌落计数。l将大肠菌（25922）或经检定标化的菌片，通过合适的梯度稀释，选择合适的稀释度进行菌落计数实验操作。361培养24h进行菌落计数。微生物检验质控方法（二）l菌落计数精密度控制重复计数法l选择十个平板，每个平板具有合适的菌落数（100以内）。将平板编号，

18、由实验人员进行计数并记录结果。去掉平板编号，将平板置冰箱保存过夜，次日取出，重新给予编号，由实验人员重复计数并记录。计算每位实验人员每对结果的平均数（X）。X=（a+b）/2；相对误差（rd）计算：rd=|a+b|/X100%。其它实验人员间的相对误差范围计算：先计算所有实验人员的平均菌落数，X=x/n，要求每一结果均应在X18.2%范围内。重复计数要求l自身同一平皿重复计数误差小于7.7%l实验人员之间同一平皿重复计数误差18.2%自身同一梯度平行加样两皿间相对误小于7.7%实验人员之间同一梯度计数误差X18.2%范围l不同梯度间菌落计数最终误差小于7.7%菌种鉴定质控菌种鉴定质控l菌种鉴定

19、质控要求，对所给的微生物菌种，按有关的方法及指标进行生化、血清等方面的鉴定。l鉴定质量评价：鉴定程序是否正确；鉴定方法是否正确；具体操作技术是否熟练，结果报告是否正确。每一项设立分值为25分。总分为100分。内部质量控制的推荐频率l菌落计数精密度控制：1次/3月；l菌种鉴定控制：1次/半年或1年l盲样测定丢失的对照1次/半年实验室安全防护实验室安全防护1l培训与告之培训与告之l实验室管理人员及实验人员必须了解相关工作有关的危险。对招收新职工、工作开始发生变化或使用新方法，启用新的设备时，这点尤为重要。所有工作人员，包括清洁和服务人员都要知道。需要进行口头和书面两种方式的通知。有关仪器必须要有字

20、迹清楚的其安全使用的书面说明。实验室安全防护实验室安全防护2l标志标志l在进行致病性微生物工作的房间人口处必须要有警示标志。l实验室的房间必须以使与微生物有关的危险得以过免的方式装置，以使微生物的传播得到限制，房间还应便于清洁和消除污染工作台必须由光滑的、耐消毒剂的材料制成。难以清洁的角落、弯头及管道应尽可能地避免污染。实验室安全防护实验室安全防护3l防止空气污染防止空气污染l加热培养蒙或其它化学物质时，粉尘可扩做到空气中这可给工作人员带来过敏反应或出现其它问题因此，设计排风装置很重要，以至包括天平附近的抽风点。通常称量应按正确的安全规程进行。实验室安全防护实验室安全防护4l有毒有害物防护有毒

21、有害物防护l浓酸和碱及其它腐蚀性化学物质和毒性物质必须专门保存，尽可能锁存，以使它们引起的损害减至最低l对实验室所用的所有化学物质，实验室必须有记述其危险及操作中可能的限制的产品表l在所需的范围内工作人员必须使用人体防护装置，防护服、手套筹使用安全设施是实验人员的职责污染了的防护员应尽快地更换，离开工作室时，必须脱去。实验室安全防护实验室安全防护5l消除污染和废物的处理消除污染和废物的处理l实验室必须要有关于应如何消除溅出的微生物污染的书面说明。另外，对废物的处理，如用过的培养皿和打碎的玻璃器皿，应有固定的程序。所有被洗的物品在洗刷前均经高压灭菌，洗涤工受微生物感染的危险就可以尽可能避免。实验室安全防护实验室安全防护6l其他其他l实验室内不准吃饭、饮水及吸烟l悬浮物可影响和污染样品，均质，混合，吸移或离心期间及灼烧接种针时，可形成悬浮物，应注意防止形成悬浮物。l运用常识及良好的实验室技术可最好地避免微生物学实验室中事故的发生。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！55