最新微生物遗传育种课件,基因突变PPT课件.ppt

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1、微生物遗传育种课件微生物遗传育种课件,基基因突变因突变第一节第一节 概述：概述：突变的定义及其分类突变的定义及其分类一、突变的定义一、突变的定义 突变的概念最早是由荷突变的概念最早是由荷兰植物学家兰植物学家 H.de.Vries于于19011901年提出的。他在自家的年提出的。他在自家的菜地上找到一种野生型的拉菜地上找到一种野生型的拉马月见草（马月见草（Oenothera lamarckiana）这种植物具）这种植物具有惊人的产生遗传新类型的有惊人的产生遗传新类型的性质，性质，de.Vries de.Vries把这些新把这些新类型称为类型称为“突变突变”。8、当染色体上存在缺失时，可用、当染色

2、体上存在缺失时，可用“”来表示，缺失的部分来表示，缺失的部分表示在表示在“”符号后面的括号中，例如符号后面的括号中，例如（Lac,pro）表示染）表示染色体上乳糖色体上乳糖发发酵基因到脯氨酸基因酵基因到脯氨酸基因这这一段染色体一段染色体发发生缺失。生缺失。9、在基因符号书写时，一般应先写生化缺陷标记，然后是、在基因符号书写时，一般应先写生化缺陷标记，然后是糖发酵标记、抗药性标记和形态变异标记，最后是象糖发酵标记、抗药性标记和形态变异标记，最后是象phage一类附加体在细菌中的存在状态或细菌对这类附加一类附加体在细菌中的存在状态或细菌对这类附加体的反应和抑制基因的符号。体的反应和抑制基因的符号。

3、例如：例如：CGSC4252:F 105T thr-1 leuB6 thi-1 argE3 his-4 proA2 recA13 lacY1 galK2 mtl-1 xyl-5 ara-14 rpsL31 tsx-33 -supE44 三、突变的分类三、突变的分类1、按照突变生成的过程（或原因）来看：可分为自发突变、按照突变生成的过程（或原因）来看：可分为自发突变和诱发突变。和诱发突变。2、从、从DNA碱基序列改变多少来分可分为单点突变和多点碱基序列改变多少来分可分为单点突变和多点突变。突变。点突变点突变碱基替代碱基替代碱基插入碱基插入碱基缺失碱基缺失颠换颠换转换转换3、从阅读框架的影响来看有

4、所谓的移框突变。、从阅读框架的影响来看有所谓的移框突变。4、从对遗传信息的改变来看可将点突变中的碱基替代进一、从对遗传信息的改变来看可将点突变中的碱基替代进一步分为：同义突变（步分为：同义突变（synomymous mutation）,错义突变错义突变（missense mutation）,无义突变（无义突变（nonsense mutation）。）。5、从突变的效应背离或返回到野生型这两种方向来看分为、从突变的效应背离或返回到野生型这两种方向来看分为正向和回复突变两种。正向和回复突变两种。6、从突变的位点存在于负责基因调控的、从突变的位点存在于负责基因调控的DNA序列当中来序列当中来看分为启

5、动子上升突变和下降突变。看分为启动子上升突变和下降突变。7、从基因突变所带来的表型改变来看分为选择性突变和非、从基因突变所带来的表型改变来看分为选择性突变和非选择性突变。选择性突变。突变株突变株的表型的表型选择性突变选择性突变营养缺陷型营养缺陷型抗性突变型抗性突变型条件致死型条件致死型非选择性突变非选择性突变形态突变型形态突变型抗原突变型抗原突变型产量突变型产量突变型第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律一、不对应性一、不对应性 即突变的性状与引起突变即突变的性状与引起突变的原因无直接对应关系。的原因无直接对应关系。1.波动试验波动试验(Fluctuation test)又称变量又称变量试

6、验或彷徨试验试验或彷徨试验第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律1943年年，S.E.Luria和和M.Delbrck发表发表了利用波动试验研究细菌抗噬菌了利用波动试验研究细菌抗噬菌体突变的论文，揭开了细菌遗传学的体突变的论文，揭开了细菌遗传学的新篇章。新篇章。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律Luria等的波动试验等的波动试验2.涂布试验涂布试验(Plate spread或或Newcombe experiment)第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律1949年，年，H.Newcombe设计设计了一种与波动试验相似，但方法更为了一种与波动试验相似，但方法更为简单的证实突变自发

7、性的试验简单的证实突变自发性的试验涂涂布试验。布试验。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律Newcombe的涂布试验的涂布试验第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律3.影印试验影印试验(Replica plating)1952年，年，J.和和E.Lederberg夫妇发明了一种直接证明突变自发夫妇发明了一种直接证明突变自发性的方法性的方法-影印培养法，证明了影印培养法，证明了细菌的抗药性是发生在加入药物之细菌的抗药性是发生在加入药物之前的，而药物的作用仅是把突变型前的，而药物的作用仅是把突变型筛选出来。筛选出来。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律Lederberg等设计的平板

8、影印培养法等设计的平板影印培养法第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律二、自发性二、自发性各种性状的突变，可以在没有人各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素下自发地发生。为的诱变因素下自发地发生。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律三、稀有性三、稀有性自发突变虽可随时发生，但其突变自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在率却是极低和稳定的，一般在10-610-9之间。但特定微生物的某一特定性状之间。但特定微生物的某一特定性状的突变率是一定的。的突变率是一定的。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律1 突变率的概念突变率的概念突变率的一般定义为突变率的一般定义为:

9、任何一个菌任何一个菌体在一定时间内所发生突变的几率。体在一定时间内所发生突变的几率。突变速率突变速率(mutation rate):是指在是指在每世代每细胞每世代每细胞(或个体或个体)发生的特定的发生的特定的突变事件的平均几率突变事件的平均几率(mutation per cell per generation)。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律1 突变率的概念突变率的概念突变频率突变频率(mutation frequency):是指在群体内突变型的频率。它未必是指在群体内突变型的频率。它未必能反映突变发生的速率。因此，我们能反映突变发生的速率。因此，我们常说的突变率是指突变速率。常说

10、的突变率是指突变速率。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律2 突变率的计算突变率的计算 mtm0 mtm0M=0.69 (ntn0)/ln2 (ntn0)式中式中 M为突变率，为突变率，mt是是t时的突变细菌时的突变细菌数，数，m0为零时的突变细菌数，为零时的突变细菌数，nt为为t时细时细菌总数，菌总数，n0为零时的细菌总数。为零时的细菌总数。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律2 突变率的计算突变率的计算例例:有一株有一株Tons E.coli菌菌,从从103个细胞个细胞/ml培养培养至至108/ml，涂于营养琼脂平皿上，喷上，涂于营养琼脂平皿上，喷上T1噬噬菌体菌体,经培养后经

11、培养后,长出长出10个个Tonr菌株菌株.求突变率。求突变率。100M=0.69 1107 108 103第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律四、独立性四、独立性突变的发生一般是独立的，即在某一群突变的发生一般是独立的，即在某一群体中体中,既可发生抗青霉素的突变型，也可发生既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素的突变型或其它药物的突变型，而抗链霉素的突变型或其它药物的突变型，而且还可发生任何性状的突变型且还可发生任何性状的突变型.某一基因的突某一基因的突变变,既不提高也不降低其他任何基因的突变率。既不提高也不降低其他任何基因的突变率。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律五、诱变

12、性五、诱变性某些物理化学因素显著提高突变率的某些物理化学因素显著提高突变率的作用称为诱变作用称为诱变.通过诱变剂的作用，可以提通过诱变剂的作用，可以提高自发突变的几率，一般可提高高自发突变的几率，一般可提高10105倍。倍。第二节第二节 基因突变的规律基因突变的规律六、稳定性六、稳定性七、可逆性七、可逆性第三节第三节 诱变的机制诱变的机制一、碱基类似物在一、碱基类似物在DNA复制复制时的掺入时的掺入第三节第三节 诱变的机制诱变的机制1.5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）第三节第三节 诱变的机制诱变的机制2.2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-aminopurine，2-AP）第三节第三节 诱变的机制诱

13、变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制二、二、DNA分子上碱基的化学分子上碱基的化学修饰修饰第三节第三节 诱变的机制诱变的机制1.亚硝酸（亚硝酸（nitrous acid）引起的氧化）引起的氧化脱氨反应脱氨反应凡是含有凡是含有NH2的碱基（的碱基（A，G，C）都）都可以被亚硝酸作用，产生氧化脱氨反应，可以被亚硝酸作用，产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，然后改变配对性质，造使氨基变为酮基，然后改变配对性质，造成碱基转换突变。成碱基转换突变。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制2.NH2OH的致突变作用的致突变作用羟胺（羟胺（HA）是一种重要的化学诱变剂，）是一

14、种重要的化学诱变剂，但其作用机制比较复杂。在不同的但其作用机制比较复杂。在不同的pH和不同和不同的的NH2OH浓度时有不同的产物。在浓度时有不同的产物。在pH6.0，浓度浓度0.11.0mol/L时，它专一地与胞嘧啶起时，它专一地与胞嘧啶起反应，将胞嘧啶转变为只能与反应，将胞嘧啶转变为只能与A配对的修饰配对的修饰碱基碱基羟基亚胺（羟基亚胺（Hydoxylimine）碱基，）碱基，从而导致从而导致GCAT的转换。的转换。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制3.烷基化试剂的致突变作用烷基化试剂的致突变作用（1）烷化剂的概念：）烷化剂的概念：生物学上的烷化剂是指在正常

15、生理生物学上的烷化剂是指在正常生理条件下，能将烷基转移给重要的生物分条件下，能将烷基转移给重要的生物分子的一类化合物。子的一类化合物。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制（2）烷化剂的分类：）烷化剂的分类：根据分子中反应烷基数目（即功能根据分子中反应烷基数目（即功能基）的多寡，可将烷化剂分成单功能或基）的多寡，可将烷化剂分成单功能或多功能的烷化剂两大类。多功能的烷化剂两大类。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制（3）常见（用）的烷化剂：）常见（用）的烷化剂：乙基磺酸乙酯（乙基磺酸乙酯（EES）、甲基磺酸乙酯）、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（）、硫酸二乙酯（DES）和亚硝基）和亚硝基胍（胍（N

16、TG）等，（详见下表）。）等，（详见下表）。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制（4）烷化剂的作用机制：）烷化剂的作用机制：烷化剂能与烷化剂能与DNA分子的许多部位发分子的许多部位发生作用，结果使生作用，结果使DNA分子增加了烷基侧分子增加了烷基侧链（烷基化作用），从而改变了链（烷基化作用），从而改变了DNA的的分子结构，引起生物体发生突变。分子结构，引起生物体发生突变。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制A 直接诱发碱基错配：直接诱发碱基错配：鸟嘌呤鸟嘌呤N7位置上的烷化有利于发生位置上的烷化有利于发生电离作用，而离子化的鸟嘌呤

17、则应该具电离作用，而离子化的鸟嘌呤则应该具有同有同T而不是同而不是同C配对的倾向，因此，便配对的倾向，因此，便能产生能产生GCAT的转换。的转换。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制B 错误修复：错误修复：鸟嘌呤鸟嘌呤N7烷化作用的另一种效应是使烷化作用的另一种效应是使鸟嘌呤碱基与糖鸟嘌呤碱基与糖-磷酸的键合削弱，从而导磷酸的键合削弱，从而导致烷化的鸟嘌呤从致烷化的鸟嘌呤从DNA上逐渐地脱落下来，上逐渐地脱落下来，这个过程就是所谓的这个过程就是所谓的“烷化脱嘌呤作用烷化脱嘌呤作用”。脱。脱嘌呤形成了分子裂缝，在随后的嘌呤形成了分子裂缝，在随后的DNA复制复制过程中便会产生转换或颠换。过程中便会产

18、生转换或颠换。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制（5）NTG（NNG）的作用特点：）的作用特点：第三节第三节 诱变的机制诱变的机制三、嵌合剂的致突变作用三、嵌合剂的致突变作用吖啶类染料和吖啶类染料和ICR类化合物是通过同类化合物是通过同DNA分子结合而发生诱变作用的两类主要的分子结合而发生诱变作用的两类主要的化学诱变剂。吖啶类化合物主要有原黄素，化学诱变剂。吖啶类化合物主要有原黄素，5-氨基吖啶、吖啶橙等。氨基吖啶、吖啶橙等。ICR化合物是指由化合物是指由美国癌症研究所应用化学方法合成的美国癌症研究所应用化学方法合成的（Institute for Cancer Research)，是一些由，是

19、一些由烷化剂和吖啶类相结合的化合物。烷化剂和吖啶类相结合的化合物。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制致突变作用的机理：诱发移码突变致突变作用的机理：诱发移码突变吖啶类化合物都是平面的三环化合物，吖啶类化合物都是平面的三环化合物，大小和嘌呤大小和嘌呤-嘧啶对大致相等，在水溶液中嘧啶对大致相等，在水溶液中能与碱基堆积在一起，并插入到两个碱基对能与碱基堆积在一起，并插入到两个碱基对之间，这一过程称为嵌入（之间，这一过程称为嵌入（intercalation）。）。一个吖啶分子嵌入后，当一个吖啶分子嵌入后，当DNA分子复制转录分子复制转录时，在顺序中发现一个或两个时，在顺序中发现一个或两个“额外额外”碱

20、基，碱基，造成识别和阅读错误，产生移码突变。有时造成识别和阅读错误，产生移码突变。有时也有很低频率的单碱基缺失，引起移码突变。也有很低频率的单碱基缺失，引起移码突变。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制四、物理因素所诱发的突变四、物理因素所诱发的突变1.紫外线紫外线第三节第三节 诱变的机制诱变的机制2.电离辐射：（直接作用，间接电离辐射：（直接作用，间接作用）作用）H2OO2OH-HO2-3.热诱变的分子机制热诱变的分子机制第三节第三节 诱变的机制诱变的机制五、转座子五、转座子(Transposable elements)1.概

21、念：概念：1951年年B.Mclintock报导了她长期对玉报导了她长期对玉米颜色变化的观察和研究，推论：玉米染色米颜色变化的观察和研究，推论：玉米染色体上存在一种活动遗传因子（体上存在一种活动遗传因子（mobile genetic elements或称或称jumping genes)第三节第三节 诱变的机制诱变的机制1.概念：概念：原核或真核细胞基因组中可以从一个原核或真核细胞基因组中可以从一个位置转移到另一个位置的遗传因子叫做转位置转移到另一个位置的遗传因子叫做转座因子。座因子。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制从不同体系中分离到的转座因子往往给从不同体系中分离到的转座因子往往给予不同的符

22、号表示，如细菌的转座因子：予不同的符号表示，如细菌的转座因子：IS（insertion sequence），），Tn（transposon）；酵母的转座因子：）；酵母的转座因子：Ty（transposon yeast）；果蝇的转座因子：）；果蝇的转座因子：Copia或或FB(fold back)等等。细菌中可能转等等。细菌中可能转座的遗传因子大致可分三类：插入顺序座的遗传因子大致可分三类：插入顺序（IS）、转座子（）、转座子（Tn）和某些温和噬菌体）和某些温和噬菌体（如（如Mu-1108）。）。第三节第三节 诱变的机制诱变的机制2.引起突变的机制：引起突变的机制：（1）插入突变）插入突变（2）

23、转座子所带有的基因）转座子所带有的基因（3）造成染色体畸变）造成染色体畸变第三节第三节 诱变的机制诱变的机制3.转座因子转座因子 及转座因子引起突变的及转座因子引起突变的表示方式：表示方式：4.应说明的问题：应说明的问题：第三节第三节 诱变的机制诱变的机制六、增变基因（六、增变基因（mutator gene）1.概念概念2.机理机理第三节第三节 诱变的机制诱变的机制七、突变热点七、突变热点(hot spots of mutation)1.概念概念2.突变热点存在的原因：突变热点存在的原因：（1）形成突变热点的最主要原因是）形成突变热点的最主要原因是5-甲甲基胞嘧啶的存在基胞嘧啶的存在（2）短的

24、连续重复序列的存在）短的连续重复序列的存在（3）突变热点还与诱变剂有关）突变热点还与诱变剂有关第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素一、诱变剂接触一、诱变剂接触DNA分子前分子前1.细胞对理化诱变剂透性的影响细胞对理化诱变剂透性的影响2.细胞质中存在的物质的影响细胞质中存在的物质的影响3.基因本身所处的状态对诱变的影响基因本身所处的状态对诱变的影响第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素二、二、DNA损伤修复和基因突变损伤修复和基因突变1.光复活作用光复活作用（photoreactivation)（1）现象的发现及概念）现象的发现及概念1949年，年，A.Kelner首先

25、在放线菌中发现紫外首先在放线菌中发现紫外线照射后的光复活作用。线照射后的光复活作用。可见光对紫外线（可见光对紫外线（UV）造成的杀菌或诱变）造成的杀菌或诱变作用的修复过程，叫做光复活作用。作用的修复过程，叫做光复活作用。（2）机制）机制第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素2.切除修复（切除修复（excision repair)（1）现象的发现）现象的发现E.coli的的uvr（repair of UV damage to DNA)基因突变可大大提高细胞对基因突变可大大提高细胞对UV的敏感性。这一的敏感性。这一现象使人们推测：现象使人们推测：uvr突变基因的正常等位基突变基因的正常

26、等位基因编码参与由因编码参与由UV造成造成DNA损伤的修复酶。损伤的修复酶。1954年年 Setlow研究了这一修复过程。研究了这一修复过程。第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素与胸腺嘧啶二聚体切除修复有关的基因有与胸腺嘧啶二聚体切除修复有关的基因有UVrA，UVrB，UVrC和和UVrD。似乎。似乎UVrABC共同编码共同编码一个切除核酸酶（一个切除核酸酶（excision nuclease）。）。UVrD的的产物是依赖于产物是依赖于ATP或或GTP而结合超螺旋而结合超螺旋DNA的螺的螺旋酶旋酶II（Helicase II）。）。（2）参与修复的酶）参与修复的酶单独的单独的uv

27、rABC基因产物没有内切核酸酶的基因产物没有内切核酸酶的功能，这几种蛋白质的复合体相互作用，才能功能，这几种蛋白质的复合体相互作用，才能使使T=T的的5-端断裂，端断裂，uvrABC 编码的内切酶并编码的内切酶并不是二聚体的专一性酶，它对其它不是二聚体的专一性酶，它对其它DNA损伤均损伤均有切除修复功能。有切除修复功能。第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（2）参与修复的酶）参与修复的酶DNA聚合酶聚合酶I也参与切除修复过程。也参与切除修复过程。既然涉及到既然涉及到DNA的复制，还必需要有连接的复制，还必需要有连接酶。酶。第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（3）切

28、除修复过程）切除修复过程（切除修复模型）（切除修复模型）第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（3）切除修复过程（切除修复模型）切除修复过程（切除修复模型）第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（3）切除修复过程（切除修复模型）切除修复过程（切除修复模型）第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（3）切除修复过程（切除修复模型）切除修复过程（切除修复模型）第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（3）切除修复过程）切除修复过程（切除修复模型）（切除修复模型）（4）切除修复与光）切除修复与光复活的差异复活的差异第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发

29、生的因素3.重组修复（重组修复（recombination repair)（1）重组修复模型）重组修复模型第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（2）重组修复机制）重组修复机制（3）与光复活作用和切除修复的区别）与光复活作用和切除修复的区别第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素4.SOS（紧急呼救）修复（紧急呼救）修复（1）SOS反应的发现反应的发现1953年，年，J.Weigle发现了这样一个现象：发现了这样一个现象：经经UV照射的照射的phage感染的感染的E.coli由于大部分由于大部分的的phage已被杀死，不具有感染活性，而存活下已被杀死，不具有感染活性，而存

30、活下来的来的phage，出现许多突变。如果把经，出现许多突变。如果把经UV照射照射过的过的phage感染用低剂量的感染用低剂量的UV照射过的照射过的E.coli，存活的，存活的phage数大为增加，同时突变的数大为增加，同时突变的phage数目也随之增加，这一现象称为数目也随之增加，这一现象称为W-复活（复活（W-reactivation）第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素（2）SOS修复的机制修复的机制（2）SOS修复的机制修复的机制第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生

31、的因素5.DNA多聚酶的校正多聚酶的校正第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素三、环境因素的影响三、环境因素的影响助变剂：本身没有诱变作用，而对于助变剂：本身没有诱变作用，而对于诱变剂的诱变作用有强化效应的物质。诱变剂的诱变作用有强化效应的物质。抗变剂：本身没有诱变作用，但能减抗变剂：本身没有诱变作用，但能减弱诱变剂的诱变效应的物质。弱诱变剂的诱变效应的物质。第四节第四节 影响诱变发生的因影响诱变发生的因素素四、从突变到突变型四、从突变到突变型1.表型延迟表型延迟表型的改变落后于基因突变的现象表型的改变落后于基因突变的现象第四节第四

32、节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素2.造成表型延迟的原因造成表型延迟的原因（1）分离延迟）分离延迟:细菌在生长对数期时，往往在一细菌在生长对数期时，往往在一个细胞中有多个核个细胞中有多个核，而突变又往往只，而突变又往往只发生在一个发生在一个DNA分子上，所以只有在分子上，所以只有在细胞分裂几次后才会产生突变型菌株。细胞分裂几次后才会产生突变型菌株。（2）生理性延迟）生理性延迟:当突变发生时，相应的野生型酶分子当突变发生时，相应的野生型酶分子并没有改变。经过数次分裂后，这些野生型酶并没有改变。经过数次分裂后，这些野生型酶分子已经得到足够的稀释或降解，新的分子已经得到足够的稀释或降解，新的m

33、RNA及蛋白质开始合成，才表现缺陷型细胞。及蛋白质开始合成，才表现缺陷型细胞。第四节第四节 影响诱变发生的因影响诱变发生的因素素第四节第四节 影响诱变发生的因素影响诱变发生的因素第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制一、背景辐射和环境因素的诱变一、背景辐射和环境因素的诱变 不少不少“自发突变自发突变”实质上是由于实质上是由于一些原因不详的低剂量诱变因素的一些原因不详的低剂量诱变因素的长期综合诱变效应。长期综合诱变效应。第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制二、微生物自身所产生的诱变物质的二、微生物自身所产生的诱变物质的作用作用 1、过氧化氢的作用、过氧化氢的作用 2、微生物自身所带的转

34、座因子的作用、微生物自身所带的转座因子的作用三、三、DNA分子内部运动分子内部运动第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制（1）互变异构效应）互变异构效应 酮基酮基 T、G 酮式和烯醇式两种形式酮式和烯醇式两种形式 氨基氨基 A、C 氨基和亚氨基两种形式氨基和亚氨基两种形式第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制（2）碱基自发脱氨）碱基自发脱氨 自发脱氨自发脱氨 胞嘧啶胞嘧啶 尿嘧啶尿嘧啶 自发脱氨自发脱氨 甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶第五节第五节 自发突变的机制自发突变的机制四、环出效应四、环出效应 研究诱变作用的意义：研究诱变作用的意

35、义：一是被用于诱变育种工作中一是被用于诱变育种工作中 二是在日常生活注意避免接触诱变剂二是在日常生活注意避免接触诱变剂 第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定Ames试验：试验：1975年，美国学者年，美国学者B.Ames发明的能发明的能够利用微生物来检测药物致癌性的试验够利用微生物来检测药物致癌性的试验方法，同时支持了致癌物质是诱变剂的方法，同时支持了致癌物质是诱变剂的说法。说法。第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定一、一、Ames试验的目的试验的目的 检测某种化学药品是否是诱变剂、致检测某种化学药品是否是诱变剂、致癌剂，以及食品、饮料、药物等中是否癌剂，以及食品、饮料、药物等中是

36、否含有致癌物。含有致癌物。第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定二、二、Ames试验的原理试验的原理 根据根据“生物化学统一性生物化学统一性”的法则的法则第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定三、试验菌及对试验菌的要求三、试验菌及对试验菌的要求试验采用一组鼠伤寒沙门氏菌（试验采用一组鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的）的His-TA1535(rfa uvrB hisG46)hisG46是碱基置换是碱基置换 TA1536(rfa uvrB hisC207)hisC207是移码突变，是移码突变，可能是可能是GC对缺失对缺失 TA1537(rfa uvrB hi

37、sC3076)hisC3076是移码突变，是移码突变，可能是可能是GC对增加对增加 TA1538(rfa uvrB hisD3052)hisD3052是移码突变，是移码突变，可能是可能是GC或或CG对缺失对缺失第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定 试验菌的具有如下特点：试验菌的具有如下特点：1、基本上是单点突变的营养缺陷型、基本上是单点突变的营养缺陷型 2、丧失了切除修复功能（、丧失了切除修复功能（uvrB）3、有一个增加细胞透性的深度粗糙突变、有一个增加细胞透性的深度粗糙突变第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定 为什么采用一组已知性质的突变为什么采用一组已知性质的突变型菌株作为测

38、试菌呢？型菌株作为测试菌呢？第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定四、试验的步骤四、试验的步骤 1、将试验药品与鼠肝匀浆混合在一起、将试验药品与鼠肝匀浆混合在一起保温一段时间保温一段时间 2、将试验菌株涂于基本培养基上、将试验菌株涂于基本培养基上 3、用圆形滤纸片吸入试验药品，然后、用圆形滤纸片吸入试验药品，然后将滤纸片放入上述平皿中央，进行培养将滤纸片放入上述平皿中央，进行培养 4、观察结果、观察结果第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定五、结果判定五、结果判定 1、如在平板上无大量菌落产生，说、如在

39、平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂明试样中不含诱变剂 2、如在纸片周围有一抑菌圈，在其、如在纸片周围有一抑菌圈，在其外才是大量的菌落，说明试样中某诱变外才是大量的菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高剂的浓度很高 3、如在纸片周围即长大量菌落，说、如在纸片周围即长大量菌落，说明诱变剂浓度合适明诱变剂浓度合适第六节第六节 致癌物质的测定致癌物质的测定一、营养缺陷型的筛选一、营养缺陷型的筛选 1、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基 （1）基本培养基（）基本培养基（Minimal medium.MM)用用表示，仅能满足某微生物的野生表示，仅能满足某微生物的野生型生

40、长需要的最低成分的合成培养基。型生长需要的最低成分的合成培养基。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选（2）完全培养基（）完全培养基（Complete medium.CM）用用+表示，凡可满足一切营养缺陷表示，凡可满足一切营养缺陷株营养需要的天然或半合成培养基，一株营养需要的天然或半合成培养基，一般可在基本培养基中加入一些富含般可在基本培养基中加入一些富含Aa、维生素和碱基之类的天然物质配制而成。维生素和碱基之类的天然物质配制而成。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选（3）补充培养基（）补充培养基（Supplemental medium.SM）用用A表示，凡能满足相应的营养缺表示，凡能满足相

41、应的营养缺陷型生长需要的合成培养基，由基本培陷型生长需要的合成培养基，由基本培养基加入对某一微生物营养缺陷型所不养基加入对某一微生物营养缺陷型所不能合成的代谢产物所构成。能合成的代谢产物所构成。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选2、与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个、与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体体 第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选（1）野生型（）野生型（Wild type）从自然界中分离到的任何微生物从自然界中分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，应该能在其相应的基本培养基上生长。应该能在其相应的基本培养基上生长。（2）营养缺陷

42、型（）营养缺陷型（auxotroph）由于缺乏合成某些生长因素的能力而由于缺乏合成某些生长因素的能力而只能在只能在CM和相应的补充培养基上生长而和相应的补充培养基上生长而不能在不能在MM中生长的变异菌株。中生长的变异菌株。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选（3）原养型）原养型（prototroph）指营养缺陷型突变株经过回复突变或指营养缺陷型突变株经过回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。上与野生型相同。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选3、营养缺陷型的筛选方法、营养缺陷型的筛选方法 一般要经过诱变、淘汰野生型、检出一般要经过诱变

43、、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节和鉴定营养缺陷型四个环节第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选（1）诱变剂的处理）诱变剂的处理（2）淘汰野生型（营养缺陷型的浓缩）淘汰野生型（营养缺陷型的浓缩）第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选A.青霉素浓缩法青霉素浓缩法 1984年年 B.Davis 和和 J.Lederberg使用使用该法分离到了营养缺陷型菌。该法分离到了营养缺陷型菌。青霉素作用机制：青霉素作用机制：青霉素分子结构与细胞壁成分肽聚糖青霉素分子结构与细胞壁成分肽聚糖的五肽链的丙氨酰丙氨酸末端相似，青的五肽链的丙氨酰丙氨酸末端相似，青霉素与转肽酶反应形成青霉素酶的复合霉素与转肽酶反

44、应形成青霉素酶的复合物，从而阻碍酶的转肽作用，最终导致物，从而阻碍酶的转肽作用，最终导致干扰细胞壁的合成。青霉素只能杀死正干扰细胞壁的合成。青霉素只能杀死正在生长繁殖的细菌，对于停止分裂的细在生长繁殖的细菌，对于停止分裂的细菌不起作用。菌不起作用。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选青霉素浓缩法的步骤：青霉素浓缩法的步骤：A.细菌经诱变剂处理；细菌经诱变剂处理；B.将处理过的细菌放在完全培养基中培养；将处理过的细菌放在完全培养基中培养；C.几小时后把细菌转入不含氮源物质的基本培养基中几小时后把细菌转入不含氮源物质的基本培养基中培养；培养；D.培养在含有无机氮源及青霉素的溶液中（几个样中培养在

45、含有无机氮源及青霉素的溶液中（几个样中的青霉素的量相同）；的青霉素的量相同）；E.几小时后，从各个样中取相同量的菌液分别涂在基几小时后，从各个样中取相同量的菌液分别涂在基本培养基和选择培养基上；本培养基和选择培养基上；F.培养后观察菌数，取在基本培养基和完全培养基上培养后观察菌数，取在基本培养基和完全培养基上菌落相差最大的进一步筛选营养缺陷型。菌落相差最大的进一步筛选营养缺陷型。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选青霉素浓缩法的注意事项：青霉素浓缩法的注意事项：A.在用青霉素处理时，野生型细菌数不在用青霉素处理时，野生型细菌数不能过多；能过多；B.青霉素的作用时间也不能过长青霉素的作用时间也

46、不能过长 C.对于酵母菌和霉菌，可以采用制霉菌对于酵母菌和霉菌，可以采用制霉菌素来代替青霉素素来代替青霉素 第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选 野生型的霉菌和放线菌的孢子在基野生型的霉菌和放线菌的孢子在基本培养基上可以萌发并长出菌丝，但缺本培养基上可以萌发并长出菌丝，但缺陷型的孢子则不会。陷型的孢子则不会。将诱变后的孢子悬浮液放在基本培将诱变后的孢子悬浮液放在基本培养基上滤去菌丝则可浓缩缺陷型孢子。养基上滤去菌丝则可浓缩缺陷型孢子。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选B.菌丝过滤法菌丝过滤法第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选C.差别杀菌法差别杀菌法 细菌的芽孢远比营养体更为耐热。细菌

47、的芽孢远比营养体更为耐热。将诱变剂处理后的芽孢在基本培养基将诱变剂处理后的芽孢在基本培养基上培养一段时间，然后加热（如上培养一段时间，然后加热（如80，15min）即可浓缩缺陷型的芽孢。）即可浓缩缺陷型的芽孢。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选D.饥饿法饥饿法 微生物的某些缺陷型菌株在某些条件微生物的某些缺陷型菌株在某些条件下会自行死亡，可是如果在某一细胞中下会自行死亡，可是如果在某一细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会避免死亡，从而可被浓缩。反而会避免死亡，从而可被浓缩。（3）营养缺陷型的检出）营养缺陷型的检出 第七节第七节 突变型的筛选突变型

48、的筛选A.逐个测定法逐个测定法 把经过浓缩的缺陷型菌液接种到完全培养把经过浓缩的缺陷型菌液接种到完全培养基上，待长出菌落后分别将每一个菌落接种基上，待长出菌落后分别将每一个菌落接种到到MM和和CM上，在上，在MM上不长而在上不长而在CM上长上长的即是营养缺陷型。的即是营养缺陷型。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选B.夹层培养法夹层培养法 先在培养皿上倒一层不含细菌的先在培养皿上倒一层不含细菌的MM，冷凝后加一层含菌的冷凝后加一层含菌的MM，冷凝后再加一，冷凝后再加一层不含菌的层不含菌的MM，经培养出现菌落后在培，经培养出现菌落后在培养皿底上把菌落作标记，然后加上一层养皿底上把菌落作标记，然

49、后加上一层CM，再经培养后出现菌落多的是营养缺，再经培养后出现菌落多的是营养缺陷型。陷型。C.限量补给法限量补给法第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选 将诱变后的细菌接种在含有微量补充养将诱变后的细菌接种在含有微量补充养料的料的MM上，野生型迅速长成大菌落，缺上，野生型迅速长成大菌落，缺陷型则较慢的长成小菌落。陷型则较慢的长成小菌落。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选D.影印培养法影印培养法 将经过诱变处理的细菌涂在将经过诱变处理的细菌涂在CM的表面，的表面，待出现菌落后用灭菌丝绒将菌落影印接种到待出现菌落后用灭菌丝绒将菌落影印接种到MM上，凡在上，凡在CM上出现菌落而在上出现菌落而在M

50、M上的上的同一位置上不出现菌落的即可初步判定为营同一位置上不出现菌落的即可初步判定为营养缺陷型。养缺陷型。（4）营养缺陷型的鉴定）营养缺陷型的鉴定 可以采用生长谱法，将待测微生物可以采用生长谱法，将待测微生物（106108）混合在）混合在MM中倒入培养皿。中倒入培养皿。待冷凝后，在标定的位置上放置少量待冷凝后，在标定的位置上放置少量Aa、碱基等结晶或粉末，经培养后在缺陷型碱基等结晶或粉末，经培养后在缺陷型所需要的化合物四周会出现浑浊的生长所需要的化合物四周会出现浑浊的生长圈。圈。第七节第七节 突变型的筛选突变型的筛选二、其它突变型的筛选二、其它突变型的筛选 1、抗性突变株的筛选、抗性突变株的筛