基因治疗肿瘤策略.ppt

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1、基因治疗肿瘤策略 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗已已成成为为肿肿瘤瘤生生物物治治疗疗最最引引人人瞩瞩目目的的研研究究领领域域，是是继继手手术术、放放疗疗、化化疗疗、免免疫疫治治疗疗之之后后的的第第五五种种模式模式,是肿瘤治疗的有益补充。是肿瘤治疗的有益补充。基基因因治治疗疗就就是是用用正正常常或或野野生生型型基基因因校校正或置换致病基因的一种治疗方法。正或置换致病基因的一种治疗方法。基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1

2、.目的基因准备；目的基因准备；2.受体细胞（靶细胞）培养；受体细胞（靶细胞）培养；3.载体的选择与克隆；载体的选择与克隆；4.将目的基因导入靶细胞；将目的基因导入靶细胞；5.转导细胞的选择和鉴定；转导细胞的选择和鉴定；6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。基因治疗的主要措施有：基因治疗的主要措施有：1.基因置换基因置换（genereplacement）将致病基因整个的换以正常基因，使致病基因永久的得到更正；2.基因修正基因修正（genecorrection）将基因的突变碱基序列纠正，而正常部分给予保留；3.基因修饰基因修饰（geneaugmentation）将目的基

3、因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强；4.基因失活基因失活（geneinactivation）应用反义核苷酸或核酶特异的封闭某些致病基因的表达；区别几个概念：区别几个概念：将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移转移（transfer）针对宿主细胞叫做针对宿主细胞叫做转导（转导（transduction）而这一过程叫做而这一过程叫做转染（转染（transfection）目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做做转化（转化（t

4、ransformation）第一节第一节增强宿主抗肿瘤免疫增强宿主抗肿瘤免疫肿瘤疫苗的作用肿瘤疫苗的作用抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要包括包括一、通过一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。增强对肿瘤抗原的识别与呈递。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫通过通过APC

5、（AntigenPresentingCells）增强对肿瘤）增强对肿瘤抗原的识别与呈递。将编码目的抗原的基因，以重组抗原的识别与呈递。将编码目的抗原的基因，以重组表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子。如通过借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子。如通过主要组织相容性复合体（主要组织相容性复合体（MajorHistocompatibilityComplex，MHC）和和/或或MHC类分子抗原处理和类分子抗原处理和输送途径将抗原信息呈递给输送途径将抗原信息呈递给T淋巴细胞，从而激发体淋巴细胞，从而激发体液

6、免疫和细胞免疫。液免疫和细胞免疫。二、细胞因子的免疫基因治疗二、细胞因子的免疫基因治疗将将IL-1、IL-4、TNF、IFN等细胞因子基因导入肿等细胞因子基因导入肿瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发CD4+毒性毒性T淋巴细胞淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)反应，而导反应，而导致分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。致分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。如如Shiau等在体内给予表达干扰素等在体内给予表达干扰素-的逆转录病毒进行的逆转录病毒进行鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗鼠膀胱癌切除后的免疫基因治

7、疗,其目的是增加肿瘤细胞在其目的是增加肿瘤细胞在局部产生干扰素局部产生干扰素-,以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性细胞（这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性细胞（HelperTLymphocyte，TH）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有抑制作用。抑制作用。将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（TumorInfiltratingLymphocyte，TIL）和淋巴因

8、子激活的杀伤性）和淋巴因子激活的杀伤性细胞（细胞（LymphokineActivatedKillercell，LAK细胞），使细胞），使之活化，活化的之活化，活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤免疫的细胞因子基因产物。免疫的细胞因子基因产物。Hull等比较了伴有等比较了伴有IL-12和共刺激分子和共刺激分子B7-1（AdmIL12/B7）两个载体表达的腺病毒和单纯伴有）两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7（AdmIL-12）表达的腺病毒感染具有较

9、差免疫原性）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的的RM-9鼠前列腺癌模型，研究发现在感染的鼠前列腺癌模型，研究发现在感染的RM-9鼠肿瘤鼠肿瘤细胞中细胞中AdmIL-12/B7能介导能介导IL-12分泌和增加分泌和增加B7-1在细胞表在细胞表面的表达面的表达,通过在比较体内注射通过在比较体内注射AdmIL-12/B7、AdmIL-12和对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增和对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多加鼠的存活率。使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4+CD8+的免疫反应细胞。的免疫反应细胞。三、共刺激分子的作用三、共

10、刺激分子的作用将将MHC、类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主免疫系统识别肿瘤细胞为免疫系统识别肿瘤细胞为“异己异己”，以诱发抗肿瘤免疫，以诱发抗肿瘤免疫反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反应。应。Matubonis等研究的结果表明，某些肿瘤细胞等研究的结果表明，某些肿瘤细胞APC表面存在有共刺激分子表面存在有共刺激分子B

11、7-16（CD80）表达时，更难有）表达时，更难有效地激活效地激活CTL，基因疫苗激活的，基因疫苗激活的CTL具有高度的特异性具有高度的特异性和和MHC-I类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋白类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核酸物质的稳定具有重要意义酸物质的稳定具有重要意义。应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织。以的免疫反应只针对肿瘤而

12、不破坏正常组织。以往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始，往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始，然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个原来方法相反的研究路线，即原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿先分离可识别肿瘤特异性肽的瘤特异性肽的CTL，再通过，再通过CTL寻找其编码肽寻找其编码肽的基因。的基因。通过这种方法，发现了黑色素瘤基因通过这种方法，发现了黑色素瘤基因MAGE-1，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的特异性特异性T细胞所识别。细胞所识别。HuXueyou等等合合成成了了MAGEAL九九肽肽，负负载载自自体

13、体APC后后给给病病人人免免疫疫，发发现现可可引引起起原原位位和和远远距距离离部部位位的的自自体体黑黑色色素素瘤瘤反反应应和和特特异异性性CTL数数量量增增加加，说说明明此此法法可可诱诱导导肽肽特特异异性性CTL应应答答并并进进行行循循环环。这这一一研研究究结结果果为为特特异异性性抗抗黑黑色色素素瘤瘤的的免免疫疫治治疗疗显显示示了了良良好好的的应应用用前前景。景。免免疫疫基基因因治治疗疗有有助助于于克克服服抗抗癌癌治治疗疗中中碰碰到到的的肿肿瘤瘤异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难。异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难。第二节第二节恢复和增强抑癌基因的功能恢复和增强抑癌基因的功

14、能引入抑癌基因引入抑癌基因抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了

15、关键性的作用。的作用。用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研究阶段。如通过载有野生型究阶段。如通过载有

16、野生型P53的腺病毒载体进行瘤体内的腺病毒载体进行瘤体内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如P53、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：转导转导WT、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、腺癌增殖降低；腺癌增殖降低；转导转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺基因能使视网膜母细胞瘤

17、、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；癌增殖降低；转导转导wT-1能使裸鼠体内能使裸鼠体内wilms瘤形成下降；转导瘤形成下降；转导NF1能使神经纤维瘤病病灶减少；能使神经纤维瘤病病灶减少；增加增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。在实体肿瘤中抑癌基因在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引分子对由化疗引起的起的DNA损伤有重要的作用损伤有重要的作用,可引起细胞周期停可引起细胞周期停滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。自从自从1994年年Okamato等构建含有等构建含有p16INK4cDNA的表达载体的表达载体

18、pCMV-p16，成功地转染，成功地转染p16INK4基基因缺失的肺癌细胞系因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系和卵巢癌细胞系SKOV-3，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除去消除P53的突变，取得一定的疗效。的突变，取得一定的疗效。Nakamura等用野生型等用野生型P53肿瘤抑制基因替代肿瘤抑制基因替代疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成功，还有待于临床

19、阶段的进一步工作证明。功，还有待于临床阶段的进一步工作证明。Schrump等对食管鳞状细胞癌系，等对食管鳞状细胞癌系，Fueyo、Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行p16INK4基因替代治疗研究，证明基因替代治疗研究，证明p16INK4基因基因的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的研究发现，这种抑制作用是有选择的，对研究发现，这种抑制作用是有选择的，对Rb基因基因缺失以及缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑基因正常的肿瘤细胞无明显抑制作用。制作用。在研究中人们还发现在研究中人们还发现p16

20、INK4基因正常的癌基因正常的癌细胞株往往都有细胞株往往都有p53基因异常，基因异常，p53基因正常的癌基因正常的癌细胞株常有细胞株常有p16INK4基因变异，同时伴随基因变异，同时伴随cyclinD1的过度表达。因此，的过度表达。因此，p16INK4基因与其它基基因与其它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。Sandig等等用用p53-p16重重组组病病毒毒注注射射到到患患肝肝癌癌的的小小鼠鼠中中，肿肿瘤瘤生生长长出出现现逆逆转转，提提示示了了引引入入抑抑癌癌基因在肿瘤治疗中的前景。基因在肿瘤治疗中的前景。第第三三节节阻阻断断癌癌基基因因功功能能-反反义义核核酸酸RN

21、A干干扰扰技技术术细胞中原癌基因的表达受到严格控制。细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，等方法，阻止癌基因功能。阻止癌基因功能。反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基反义核酸技术的

22、基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的合的DNA或或RNA，以影响其靶基因的表达，抑，以影响其靶基因的表达，抑制其功能。制其功能。RNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链程，为双链RNA分子在分子在mRNA水平上关闭相关水平上关闭相关基因表达的过程基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。是一项新兴的基因阻断技术。RNAi是一种转录后基因沉默是一种转录后基因沉默(posttranscriptionalgen

23、esilencing,PTGS)现象。现象。有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。1995年年Gou等在对线虫的实验中发现等在对线虫的实验中发现,正义正义RNA与反与反义义RNA一样可以阻断一样可以阻断par-1基因的表达基因的表达,但作者对这但作者对这一现象没有进行更深入的研究。一现象没有进行更深入的研究。1998年年,Fire等首次将正义链和反义链的等首次将正义链和反义链的RNA结合物结合物双链双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)注入注入线虫线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强

24、得多的基因沉默强得多的基因沉默,每个细胞只要很少几个分子的双每个细胞只要很少几个分子的双链链RNA就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实验还证实验还证实,在线虫体内注入双链在线虫体内注入双链RNA,不但可以阻断不但可以阻断整个线虫的所有同源基因的表达整个线虫的所有同源基因的表达,还会导致其第还会导致其第1代代子代的同源基因沉默子代的同源基因沉默,他们将这种现象命名为他们将这种现象命名为RNAi。此后，在多种生物体内陆续发现了。此后，在多种生物体内陆续发现了RNAi现象现象,许许多多学学者者认认为为,在在生生物物中中广广泛泛存存在在的的PTGS现现象象可可视

25、视作作不不同物种所共有的适应保护机制同物种所共有的适应保护机制:通通过过阻阻抑抑大大量量的的异异常常mRNA表表达达,抵抵抗抗转转座座子子和和病病毒毒的的侵侵袭袭,以保护机体免于受损以保护机体免于受损,相当于基因组的免疫系统；相当于基因组的免疫系统；通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。RNAi在在哺哺乳乳动动物物中中的的研研究究主主要要集集中中在在干干扰扰病病毒毒在在体体内内的的复复制制、抑抑制制癌癌基基因因表表达达及及基基因因敲敲除除后后基基因因功功能能的的研研究究等等方方面。面。与与传传统统的的基基因因研研究究方方法法基基因因

26、敲敲除除、定定点点突突变变、反反义义核核酸酸及及核核酶酶技技术术等等相相比比，RNAi具具有有以以下下五大特点：五大特点：基因序列特异性；基因序列特异性；dsRNA的稳定性；的稳定性；沉默信号传递性；沉默信号传递性；Knock-down高效性；高效性；RNAi效用浓度依赖性。效用浓度依赖性。一、一、RNAi的分子机制的分子机制外源性外源性(如病毒如病毒)或内源性的或内源性的dsRNA在细胞内与一种在细胞内与一种RNA酶酶(RNAase核酸内切酶核酸内切酶)Dicer结合结合,随即被切割随即被切割成成2123nt的带有的带有3端单链尾巴及磷酸化端单链尾巴及磷酸化5端的短链端的短链dsRNA,即即

27、小干扰小干扰RNA（smallinterfereingRNA,siRNA）。siRNA与与Dicer形成形成RNA引导沉默的复合体引导沉默的复合体(RNAinducessilencingcomple,RISC)。siRNA作为引导序列作为引导序列,按照碱基互补原则识按照碱基互补原则识别靶基因转录出的别靶基因转录出的mRNA,并引导并引导RICS结合结合mRNA。随后。随后siRNA与与mRNA在复合体中换位在复合体中换位,核酸酶核酸酶Dicer将将mRNA切切割成割成2123nt的片段的片段,特异性地抑制靶基因的表达。而新产特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的生的dsRNA片段可再次形成片段可

28、再次形成RISC,继续降解继续降解mRNA,从而产从而产生级联放大效应。因此生级联放大效应。因此,每个细胞只需要几个每个细胞只需要几个siRNA分子就分子就能够引起强烈的能够引起强烈的RNAi效应。此外效应。此外,siRNA还可以在还可以在RNA依依赖性赖性RNA聚合酶聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp)的的作用下进行大量扩增作用下进行大量扩增,并转运出细胞并转运出细胞,使使RNAi扩散到整个机扩散到整个机体并可以传代。体并可以传代。阐阐明明siRNA在在双双链链RNA诱诱发发的的基基因因沉沉默默中中的的作作用用是是RNA干干扰扰研究中最重要的研究中最重要的发

29、现发现之一。达到之一。达到这这一目的有几种途径：一目的有几种途径：利利用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体转转化化或或转转染染瘤瘤细细胞胞，在在细细胞胞内内转转录录出出能能与与目目的的基基因因正正义义RNA相相互互补补的的反反义义RNA，从从而而阻阻断目的基因蛋白断目的基因蛋白质质的表达。的表达。体外人工合成反义寡聚核苷酸。体外人工合成反义寡聚核苷酸。由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而脱氧核苷酸也同样可以与脱氧核苷酸也同样可以与RNA相互配对结合，所以在实践相互配对结合，所以在实践中多用反义核苷酸（中多用反义核苷酸（anti

30、senseoligodeoxyribonucleotide,AS-ODN）。）。与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地阻断疾病的发生发展。阻断疾病的发生发展。二、二、RNAi在在肿肿瘤治瘤治疗疗中的意中的意义义ras基因包括基因包括K-ras、H-ras、N-ras,是鸟苷酸结合是鸟苷酸结合蛋白蛋白,对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用。对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用。ras基因突变可使之处于长期激活基因突变可使之处于长期激活GTP结合状态结合状态,易导致肿易导致肿瘤的发生。瘤的发生。K-ras基因在人类肿瘤中最普遍活化状

31、态的基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致癌基因，在肿瘤组织中的突变率致癌基因，在肿瘤组织中的突变率30-50%，在胰腺癌中，在胰腺癌中高达高达85%。突变的。突变的Ras基因与正常细胞中的野生型基因与正常细胞中的野生型ras基基因通常只有一个碱基的不同，但由于因通常只有一个碱基的不同，但由于RNAi的高度特异的高度特异性，可以针对肿瘤细胞中突变的性，可以针对肿瘤细胞中突变的ras基因产生抑制作用，基因产生抑制作用，而对正常细胞的野生型而对正常细胞的野生型ras不产生抑制作用。不产生抑制作用。最近最近Li-MoChen等报道建立等报道建立K-rasV12突变基因的突变基因的siRNA腺病毒表达载体

32、腺病毒表达载体,转染转染Panc-1胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转肿瘤恶性表型。肿瘤恶性表型。WeiWang等通过构建等通过构建K-ras基因的基因的siRNA表达框架表达框架(siRNAexpressioncassette,SEC)成功抑制胰腺癌细胞株成功抑制胰腺癌细胞株MiaPaCa-2的的K-ras表达。表达。Fleming等报道，利用化学合成等报道，利用化学合成anti-K-ras-siRNA抑制了抑制了PANC-1和和MaiPaca-2胰腺癌细胞胰腺癌细胞K-ras的表达，并观测到的表达，并观测到集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增集落形成能力、细胞增殖

33、能力和侵袭能力降低、凋亡增加，与加，与VEGF）和血小板反应素（）和血小板反应素（thrombspondin-1，TSP-1）基因和）基因和c-myc的下游调控元件、与肿瘤转移相关的下游调控元件、与肿瘤转移相关的葡萄糖转运蛋白的葡萄糖转运蛋白1（glucosuetransporter，GLUT-1）基因表达变化。基因表达变化。癌胚抗原相关细胞黏附分子癌胚抗原相关细胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球）是免疫球蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的形成、抵抗形成、抵抗“失巢凋亡失巢凋亡”（anoikis：正常内皮细胞或表：正常内皮细胞或

34、表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）和形成转移起到重要作用。和形成转移起到重要作用。DuxburyMS等通过化学合成等通过化学合成anti-CEARAM6-siRNA抑抑制失巢凋亡高抵抗性制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌细胞株的胰腺癌细胞株的CEARAM6的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低。他们还分肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低。他们还分别利用逆转录病毒别利用逆转录病毒siRNA表达载体和化学合成的方法介表达载体和化学合成的方法介导了对

35、导了对CEARAM6基因高表达基因高表达BXPC3胰腺癌细胞株胰腺癌细胞株CEARAM6基因的敲减基因的敲减,观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、转移瘤生成能力下降，进一步证明了转移瘤生成能力下降，进一步证明了CEARAM6基因在基因在肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的RNAi治治疗提供了作用靶点。疗提供了作用靶点。BCR/ABL融合基因是定位于人融合基因是定位于人9q34上的上的C-ABL基因和基因和22q11上的上的BCR基因发生基因发生t(9:22)易位，使相应无关的基因易位，使相应无关的基因发生融合而形成，它是发生融合而

36、形成，它是PH染色体的分子基础，在染色体的分子基础，在CML发发病中起到重要作用。病中起到重要作用。Borkhardt等采用等采用RNAi技术成功地抑制了技术成功地抑制了K562白血病细白血病细胞中的胞中的BCR/ABL融合基因融合基因mRNA的表达，增加对的表达，增加对K562白白血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合ABL酪氨酸抑制剂酪氨酸抑制剂-Imatinib治疗时，对细胞凋亡没有相加作用。治疗时，对细胞凋亡没有相加作用。RNAi技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前进。进。RNAi在医学领域的应用也必将为各种疾病

37、尤其是在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是肿瘤等疾病的根治带来希望。但是肿瘤等疾病的根治带来希望。但是,从目前从目前RNAi的研究的研究现状来看现状来看,在哺乳动物中在哺乳动物中,RNAi并不能完全阻断基因的表并不能完全阻断基因的表达达,尤其是异常高表达的基因尤其是异常高表达的基因,这将促使人们去探索研究这将促使人们去探索研究新的更高效新的更高效siRNA表达载体体系。为了促进基于表达载体体系。为了促进基于RNAi的基因药物进入临床研究和应用的基因药物进入临床研究和应用,大量的研究已集中到大量的研究已集中到提高提高siRNA分子的工业化生产能力、增加分子的工业化生产能力、增加siRNA分子稳

38、分子稳定性、开发定性、开发siRNA药物的靶向传递系统等方面。尽管如药物的靶向传递系统等方面。尽管如此此,RNAi在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就,因因此我们有理由相信此我们有理由相信RNAi必将对癌症的最终根治起到重必将对癌症的最终根治起到重要的作用。要的作用。第四第四节节核核酶酶用于基因治用于基因治疗疗1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶(Ribozyme)。这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域。核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无蛋白质的条件下切割靶

39、蛋白质的条件下切割靶RNA分子分子。核酶用于基因治疗的条件是核酶用于基因治疗的条件是找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序列）必须是已知的，以便设计核酶的切列）必须是已知的，以便设计核酶的切割位点；割位点；所设计的核酶必须能够切割靶所设计的核酶必须能够切割靶RNA；肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，并能在细胞内切割靶并能在细胞内切割靶RNA。反义治疗并不像刚开始人们所想像的反义治疗并不像刚开始人们所想像的那么简单，目前还有许多关键性问题有那么简单，目前还有许多关键性问题有待去

40、解决，如生物学稳定性，药物的释待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异性放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等。应用反所引起的作用包括毒副作用等。应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的或端粒酶的RNA部分。部分。第五第五节节抗抗肿肿瘤血管生成的基因治瘤血管生成的基因治疗疗 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关关,由于肿瘤的血管生成受到

41、血管生长因子、血管由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控生长抑制因子以及其它的因子的共同调控,因此通因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。制因子的表达均可达到治疗的目的。一、阻断血管生一、阻断血管生长长因子的作用因子的作用 主要是采用反义主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的VEGF的拮抗物输入鼠卵巢的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制癌抑制VEGF的活性的活性；利用含有利

42、用含有VEGFcDNA的腺病毒载体转染乳腺癌的腺病毒载体转染乳腺癌细胞细胞,用以拮抗用以拮抗VEGF的促血管生成作用的促血管生成作用；用抗用抗VEGF的核酶抑制的核酶抑制VEGF的表达的表达,使卵巢癌使卵巢癌生长及血管生成减少的报告。生长及血管生成减少的报告。针对其它的血管生成因子的治疗针对其它的血管生成因子的治疗,如如bFGF,缺氧缺氧诱导因子诱导因子(HIF),EGF,PDGF,PDECGF,IGF,Ets-1,HGF等的因子的治疗。等的因子的治疗。Zhang等用等用VEGFsiRNA特异性地抑制特异性地抑制VEGF的表达的表达,成功地抑制小鼠卵巢癌上皮成功地抑制小鼠卵巢癌上皮ID8细胞的

43、增殖。细胞的增殖。TSP1是一种是一种血管抑制因子血管抑制因子,它可以抑制它可以抑制mmp9基因的激活基因的激活,从而抑制肿从而抑制肿瘤的生长。一般说来瘤的生长。一般说来,肿瘤细胞能够通过抑制肿瘤细胞能够通过抑制TSP1的表达的表达来达到其指数增殖的目的。通常情况下来达到其指数增殖的目的。通常情况下,VEGF能够抵制能够抵制TSP1的血管生长抑制作用。的血管生长抑制作用。Filleur等用等用VEGFsiRNA转染转染肿瘤细胞肿瘤细胞,发现发现VEGFsiRNA抑制效应可以与分泌抑制效应可以与分泌TSP1的的肿瘤细胞协同作用肿瘤细胞协同作用,抑制肿瘤的生长抑制肿瘤的生长,并且并且VEGFsiR

44、NA能能阻止阻止TSP1耐受细胞的出现耐受细胞的出现,并极大地抑制了这些细胞的生并极大地抑制了这些细胞的生长速度。长速度。二、上二、上调调血管生血管生长长抑制因子抑制因子 用重组血管抑素用重组血管抑素cDNA输入消化道肿瘤输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果可取得较好的治疗效果,用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和内皮细胞迁移和VEGF介导的血管生成介导的血管生成,病毒载体介导的重组编码病毒载体介导的重组编码PF4的反义基因显的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。示出抗鳞癌血管生长的作用。三三、抑抑制制细细胞胞外外基基质质和和基基膜膜降降解解以以

45、及及抑抑制制内内皮皮细细胞特异性粘附分子的作用胞特异性粘附分子的作用 用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的T1MP-1基因转染肿基因转染肿瘤细胞瘤细胞,瘤细胞产生的瘤细胞产生的T1MP-1抑制了抑制了MMP-2,MMP-9的活性的活性,使内皮细胞的迁移受到抑制。使内皮细胞的迁移受到抑制。Gondi等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义反义uPAR和和uPA治疗胶质瘤治疗胶质瘤,明显抑制了肿明显抑制了肿瘤的血管生成。瘤的血管生成。第五节第五节、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因（自杀基因（suici

46、degene）治疗思路就是人为地）治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态，将一些改变肿瘤细胞的状态，将一些“自杀基因自杀基因”(TK基因、基因、CD基因和较新的细胞色素基因和较新的细胞色素p450-2B1基因基因)转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。用。一、旁一、旁观观者效者效应应与机制与机制1、旁、旁观观者效者效应应(bystandereffect)几几乎乎所所有有的的自自杀杀基基因因系系统统都都具具有有

47、旁旁杀杀伤伤效效应应，即即不不仅仅转转导导自自杀杀基基因因的的细细胞胞可可以以被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导自自杀杀基基因因的的细细胞胞亦亦可可被被杀杀死死。研研究究发发现现旁旁杀杀伤伤效效应应一一般般是是1：10，即即一一个个基基因因修修饰饰细细胞胞死死亡亡时时带带动动10个个基基因因未未修修饰饰细细胞胞死死亡亡，由由此此可可见见“旁旁观观者者效效应应”明明显扩显扩大了自大了自杀杀基因的基因的杀伤杀伤作用。作用。2、旁、旁观观者效者效应应的可能机制的可能机制磷酸化的磷酸化的巯巯基通基通过缝过缝隙隙连连接在同接在同类细类细胞胞间传递间传递；自自杀杀基基因因（TK-GCV

48、）介介导导的的细细胞胞死死亡亡表表现现为为凋凋亡亡，临临近近未未转转染染细细胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有GCV三磷酸代三磷酸代谢产谢产物；物；自自杀杀基基因因可可使使肿肿瘤瘤从从免免疫疫抑抑制制转转变变为为免免疫疫刺刺激激，包包括括各各种种细细胞因子胞因子释释放和免疫放和免疫细细胞浸胞浸润润的的级联级联反反应应；死亡细胞中抗原暴露，被周围死亡细胞中抗原暴露，被周围APC摄取而产生抗肿瘤免疫。摄取而产生抗肿瘤免疫。二、靶向基因表达和治二、靶向基因表达和治疗疗 应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自杀基因要有一定

49、的表达效率。其次，导入的基因要局限杀基因要有一定的表达效率。其次，导入的基因要局限于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问题。增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤题。增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达。肿瘤细胞内具特异性调控元件去调节自杀基因的表达。肿瘤细胞内具有特异性转录激活因子，能激活特定蛋白的转录表达，有特异性转录激活因子，能激活特定蛋白的转录表达，而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激

50、活因子。因列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激活因子。因此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗的目的，正常细胞则不能表达。的目的，正常细胞则不能表达。在各种调控序列中，组织特异性启动子常被用作启动目的基在各种调控序列中，组织特异性启动子常被用作启动目的基因在靶组织中高度表达，如甲胎蛋白基因启动子（因在靶组织中高度表达，如甲胎蛋白基因启动子（pAF