微生物的实验室培养(课件).ppt

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1、湖南长郡卫星远程学校湖南长郡卫星远程学校2009年上学期制作 03微生物的实验室培养(课件)Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 了解有关微生物及培养基的基础知了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。的培养。一、课题目标：一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功

2、地培养微生物。地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：微生物微生物病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物原核生物界原核生物界原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界是一切肉眼看不见或看不清楚的微是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。小生物的总称。微生物微生物1.1.分类分类2.病病 毒毒朊病毒（蛋白质病毒）朊病毒（蛋白质病毒）病毒的增殖病毒的增殖细菌的外形与大小细菌的外形与大小 3.3.细菌细菌图图1-1 常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典型形态A.球菌球菌 B.杆菌杆菌

3、C.弧菌弧菌ABC细菌的构造细菌的构造细菌细胞由细菌细胞由外向里依次外向里依次有有鞭毛鞭毛、菌、菌（纤）毛、（纤）毛、荚膜荚膜、细胞细胞壁壁、细胞膜、细胞膜、细胞质细胞质，核，核区等。区等。伤伤寒寒杆杆菌菌细细胞胞壁壁中中含含毒毒素素细胞壁细胞壁坚韧且有弹性坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？细胞壁有哪些功能？固定细胞外形；固定细胞外形；保护细胞免受保护细胞免受外力的损伤；外力的损伤；阻拦大分子物阻拦大分子物质进人细胞；质进人细胞；使细胞具有致使细胞具有致病性及对噬菌体病性及对噬菌体的敏感性。的敏感性。芽孢的壁很芽孢的壁很厚厚，对干旱、低温、高温等恶劣的，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力

4、。环境有很强的抵抗力。芽孢又芽孢又小小又又轻轻，可以随风飘散。，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。孢又可以萌发，形成一个细菌。芽孢：芽孢：细菌形成细菌形成的椭圆形的休眠的椭圆形的休眠体体异养菌：异养菌：腐生菌：腐生菌：枯草杆菌枯草杆菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌光合自养型：光合自养型：光合细菌光合细菌化能自养型：化能自养型：硝化细菌，铁细菌，硫细菌硝化细菌，铁细菌，硫细菌细菌的营养类型细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。将细菌分

5、为两大营养类型。自养菌：自养菌：分类，举例分类，举例?菌落菌落单个或少数细菌在固体培养基上大单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落。菌落是鉴定菌种的菌落是鉴定菌种的重要依据。重要依据。细菌的细菌的菌落特菌落特征因种征因种而异而异 菌落菌落 4.4.放线菌放线菌结构：结构：单细胞原核单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）（2）繁殖）繁殖孢孢子子丝丝|孢孢子子链霉素、土霉素、四环素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、

6、庆大霉素氯霉素、红霉素、庆大霉素 微生物中发现了几千种抗生素，其微生物中发现了几千种抗生素，其中中2/3是由放线菌产生的是由放线菌产生的 应用应用:5.5.真菌真菌如上图是酵母菌电子显微镜下的形态结构如上图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌青霉青霉生生 殖殖腐生生活腐生生活孢子生殖孢子生殖一、基础知识：一、基础知识：（一）培养基（一）培养基 培养基（液）是培养基（液）是由人工方法配制而成的，专由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合供微生物生长繁殖使用的混合营养基质营养基质。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途（1 1）按物理状态来分：）按物理状态来分：液

7、体培养基液体培养基+琼脂琼脂（半固体培养基）（半固体培养基）固体培养基（固体培养基（用于菌种分离、鉴定等。用于菌种分离、鉴定等。）（2 2）按功能来分：）按功能来分：选择培养基和鉴别培养基。选择培养基和鉴别培养基。（3 3）按成分来分：）按成分来分：天然培养基和合成培养基。天然培养基和合成培养基。单个或少数单个或少数细细菌在固体培养基上菌在固体培养基上大量繁殖时，就会大量繁殖时，就会形成形成一个一个肉眼可见肉眼可见的，具有一定形态的，具有一定形态结构的子细胞群体，结构的子细胞群体，叫做菌落。叫做菌落。用途：用途：纯化（分离），纯化（分离），鉴定、活菌计鉴定、活菌计数、保藏菌种数、保藏菌种固体培

8、养基：菌落固体培养基：菌落液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长 均匀混浊均匀混浊生长生长沉淀生长沉淀生长用途：增菌、工业生产用途：增菌、工业生产半固体培养基：半固体培养基：无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)用途：动力检测用途：动力检测培养基的种类培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基选择培养基鉴别培养基鉴别培养基据用途分据用途分常用于工业生产常用于观察微生物的运动、鉴定菌种用于微生物的分离、计数常用于工业生产常用于分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青

9、霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并物就与伊红和美蓝结

10、合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。带有金属光泽。选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基核苷的培养基:分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞

11、 根据细胞生存所需物质的种类根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。一些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分和含量相标准化生产，组分和含量相对固定对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:天然培养基有血清、血浆、和组天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：

12、营养成分丰富，培养效果好营养成分丰富，培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复杂，影响对某成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染易发生支原体污染;天然培养基：天然培养基：2.2.营养营养C、H、O、N、P、S四四大营养类型大营养类型碳源碳源氮源氮源水水无机盐无机盐微生物主要的化学元素组成：微生物主要的化学元素组成：另外还需要满足微生物生长对另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质、特殊营养物质,例如例如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如如维生素、某些氨基酸、

13、嘌呤、嘧啶维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。渗透压等的要求。4、微生物的五种营养要素、微生物的五种营养要素碳源（carbon source）氮源（nitrogen source）生长因子（growth factor）无机盐（mineral salts）水（wahtor）Cncnc-micro 凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质都称为碳源的营养物质都称为碳源。Cncnc-micro碳源碳源C素构成细胞及代谢产物的骨架素构成细胞及代谢产物的骨架C素是大多数微生物代谢所需的能量来源素是大多数微生物代谢所

14、需的能量来源自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为惟一自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为惟一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。有机物作为碳源进行代谢生长。碳源是异养微生物的主要能源物质。碳源是异养微生物的主要能源物质。碳源功能无机无机C源：源：CO2、碳酸盐，只能被自养微生、碳酸盐，只能被自养微生物利用物利用有机有机C源：各种糖类，其次是有机酸、醇源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、类、脂类和烃类化合物脂类和烃类化合物碳源种类Cncnc-micro 凡凡是是能能为为微微生生物物提提供供所所需需氮氮元元素素的的营营养养物物质都称为氮源。质都称为氮源

15、。氮源(nitrogin source)Cncnc-micro 为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料对许多微生物来说，既可利用无机态氮，也可对许多微生物来说，既可利用无机态氮，也可利用有机态氮。利用有机态氮。固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如NH3既是硝化细菌的氮源又是能源，含既是硝化细菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白质等也能为微生物提供能量。的蛋白质等也能为微生物提供能量。氮源功能氮源功能Cncnc-micro分子态氮：固氮

16、微生物以分子氮为唯一氮源分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用有机态氮：蛋白质及其降解产物有机态氮：蛋白质及其降解产物a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等氮源种类氮源种类Cncnc-micro 构成微生物细胞的组成成分构成微生物细胞的组成成分调解微生物细胞的渗透压，调解微生物细胞的渗透压，PH值和氧值和氧化还原电化还原电位位有些无机盐如有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生还可做为自养微生物的能源物

17、的能源构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂是多种酶的激活剂无机盐（无机盐（mineral saltsmineral salts）无机盐功能无机盐功能Cncnc-micro 构构成成微微生生物物细细胞胞以以C、H、O、N、P、S六六种种元素为主，约占细胞干重的元素为主，约占细胞干重的95以上；以上；Ca、K、Mg、Fe为为大大量量元元素素，以以无无机机盐盐阳阳离离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等等微微量量元元素素，在在微微生生物物培培养养中中有有0.

18、1PPM就就可可以以了了，自自来来水水原原料料中中已够用，不需另加。已够用，不需另加。无机盐种类无机盐种类Cncnc-micro 微生物生长不可缺少的微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生长因子。微量有机物质叫生长因子。维生素 氨基酸碱 基 Cncnc-micro生长因子生长因子 有的微生物自己不能合成维生素，有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是需要外加，主要是B族维生素、硫胺素、族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（是加生物素（是B族中的一种即族中的一种即VH）。）。维生素维生素Cncnc-micro 有有些些微微生生物物自自

19、己己不不能能合合成成某某种种氨氨基基酸酸，必必须须给给予予补补充充，如如赖赖AA发发酵酵所所用用的的黄黄色色短短杆杆菌菌不不能能合合成成环环丝丝AA，为为环环丝丝AA缺缺陷陷型型菌菌株株，在在培培养养基基中中必必须须添添加加含含环环丝丝AA的的氮氮源源。如如豆豆饼饼水水解解液液或或毛毛发发水水解液等。解液等。氨基酸氨基酸Cncnc-micro 嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。是许多微生物必须的生长因素。有有些些微微生生物物不不仅仅不不能能合合成成嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤，而而且且不不能能将将补补充充的的嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤结结合合在在

20、核核苷苷酸酸上上，还还必必须须供供给给核核苷苷酸酸，有有的的菌菌需需补补充充卟卟啉啉或或其其衍衍生生物物，还还有有的的菌菌需需供供给给（低碳）脂肪酸等。（低碳）脂肪酸等。碱基碱基Cncnc-micro水水Cncnc-micro 是细胞中生化反应的良好介质；营养是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。维持细胞

21、的膨压（控制细胞形态）。1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成培养基组分培养基组分提供的主要营养提供的主要营养牛肉膏牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨蛋白胨10g氮源和维生素氮源和维生素NaCl 5g无机盐无机盐H2O定容在定容在1000mL 氢元素、氧元素氢元素、氧元素不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方碳源、氮源、生长因子的比较碳源、氮源、生长因子的比较来来源源常用原料常用原料功功能能碳源碳源CO2、NaHCO3、糖、糖类、脂肪酸、类、脂肪酸、花生粉花生粉饼、石油等饼、石油等糖类糖类构成细胞物质

22、构成细胞物质和一些代谢产和一些代谢产物，有些还是物，有些还是异养做生物的异养做生物的主要能源物质主要能源物质氮源氮源N2、NH3、铵盐、硝、铵盐、硝酸盐、尿素、酸盐、尿素、牛肉膏牛肉膏和蛋白胨等和蛋白胨等铵盐、硝酸铵盐、硝酸盐等盐等合成蛋白质、合成蛋白质、核酸以及含氮核酸以及含氮的代谢产物的代谢产物生长生长因子因子维生素、氨基酸、碱维生素、氨基酸、碱基基酶、核酸等的酶、核酸等的组成成分组成成分3、培养基配制原则：（1）目的要明确目的要明确：根据微生物的种类、培养：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。生物

23、对培养物质的需求不同。（2）营养要协调营养要协调：注意各种营养物质的浓度：注意各种营养物质的浓度和比例。和比例。（3）pH要适宜要适宜：各种微生物适宜生长的：各种微生物适宜生长的pH范范围不同。围不同。真菌真菌pH为：为：5.0-6.0。细菌细菌pH为：为：6.5-7.5；放线菌放线菌pH为：为：7.5-8.5；（二）无菌技术（二）无菌技术 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止外来杂菌污染的方法。（所有防止外来杂菌污染的方法。（获得获得纯净培养物的关键。）纯净培养物的关键。）1 1）清洁和消毒）清洁和消毒2 2）灭菌）灭菌 3 3）酒精灯附近进行）酒精灯

24、附近进行.4).4).避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触1.1.注意项：注意项：（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：是指使用强烈的理化因素杀死物体内外是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的所有的微生物，包括所有细菌的孢子、芽孢、微生物，包括所有细菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而达到霉菌及病毒，而达到完全无菌完全无菌之过程。之过程。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。普通也是最重要的技术。利用化学或物理

25、方法，杀死大部份致利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。病微生物的过程。比比较较项项理化因素理化因素的作用强的作用强度度消灭微生消灭微生物的数量物的数量芽孢和孢芽孢和孢子能否被子能否被消灭消灭消消毒毒较为温和较为温和部分生活部分生活状态的微状态的微生物生物不能不能灭灭菌菌强烈强烈全部微生全部微生物物能能消毒与灭菌的比较消毒与灭菌的比较1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75

26、%75%酒精、新洁酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(1)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法1 1、灼烧灭菌灼烧灭菌接种环、接种针、接种环、接种针、试管口试管口2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加下加热热1-2h1-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min.(2)灭菌的方法：灭菌的方法：最常用的灭菌方法是最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌，它可以，它可以杀灭

27、所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。破坏。有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌高温干热灭菌。为了。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养微生

28、物的培养皿是由培养微生物的培养皿是由正反两平面板互扣正反两平面板互扣而成而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。而设计的。1.无菌技术除了用来防止实验室无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？还有什么目的？旁栏思考旁栏思考 1.无菌技术除了用来防止实验室无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？还有什么目的？答：无菌技术还能有效避免操作答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。者自身被微生物感染。旁栏思考旁栏思考

29、2.请你判断以下材料或用具是否需请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿 （2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3）实验操作者的双手实验操作者的双手 2.请你判断以下材料或用具是否需请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿 （2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3）实验操作者的双手实验操作者的双手 答：（答

30、：（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；）需要灭菌；（3 3）需要消毒。）需要消毒。微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序1.1.器具的灭菌器具的灭菌2.2.培养基的配制培养基的配制3.3.培养基的灭菌培养基的灭菌4.4.倒平板倒平板5.5.微生物接种微生物接种6.6.恒温箱中培养恒温箱中培养7.7.菌种的保存菌种的保存三、实验操作三、实验操作(一一)制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌用于培养细菌)牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏牛肉膏 5.0g蛋白胨蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g琼脂琼脂 20.0g将上述物质溶解后

31、，添加自来水，定将上述物质溶解后，添加自来水，定容至容至1000mL1计算计算、称量称量2溶化溶化3调调pH：pH764过滤：这一步可以省去。过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞加塞7包扎包扎操作步骤操作步骤8灭菌灭菌:将将50ml培养基用玻棒转移至三角锥培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌

32、锅，在压力为入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为温度为121，灭菌，灭菌1530min。将培养。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在在160170 下灭菌下灭菌2h。9倒平板倒平板:待培养基冷却到待培养基冷却到50 左右时，在酒左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接后观察平板，无杂菌污染才可用来接种种.10无菌检查：无菌检查：将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培的温室中培养养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术倒平板

33、技术1.将灭过菌的将灭过菌的培养皿放在火培养皿放在火焰旁的桌面上，焰旁的桌面上，右手拿装有培右手拿装有培养基的锥形瓶，养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。左手拨出棉塞。1234倒平板技术倒平板技术2.右手拿锥形右手拿锥形瓶，使瓶口迅瓶，使瓶口迅速通过火焰。速通过火焰。1234倒平板技术倒平板技术12343.用左手的拇指用左手的拇指和食指将培养皿和食指将培养皿打开一条稍大于打开一条稍大于瓶口的缝隙，右瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的手将锥形瓶中的培养基培养基(约约1020mL)倒入培养倒入培养皿，左手立即盖皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。上培养皿的皿盖。倒平板技术倒平板技术12344.等待平板冷等待平板冷却凝

34、固，大约却凝固，大约需需510min。然后，将平板然后，将平板倒过来放置，倒过来放置，使皿盖在下，使皿盖在下，皿底在上。皿底在上。倒平板技术倒平板技术倒平板技术倒平板技术 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？法来估计培养基的温度？问题讨论问题讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥

35、形瓶的温度下降到刚刚锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。不烫手时，就可以进行倒平板了。问题讨论问题讨论 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，使培养基表面的水分更好地挥发，又可

36、以防止皿盖上的水珠落入培养又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？答：空气中的微生物可能在皿答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微因此最好不要用这个平板培养微生物。生物。平板划线法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀将聚集的

37、菌钟逐步稀释分散到培养基的表面释分散到培养基的表面.在数次画线后在数次画线后,可以分离到可以分离到由一个细胞繁由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是这就是菌落菌落.（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法和稀释涂布平板法微生物的接种技术：微生物的接种技术：平板划线的操作方法平板划线的操作方法 交叉划线法交叉划线法 连续划线法连续划线法 平板划线的操作平板划线的操作 一旦划破，会造成划线不均匀，一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无二

38、是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。菌落细菌的菌细菌的菌落特征因落特征因种而异种而异 霉菌的霉菌的菌落特菌落特征征因种而因种而异异菌落问题讨论问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时线操作结束时,仍然需要灼烧接种环仍然需要灼烧接种环吗？为什么？吗？为什么？答：答：操作的第一步灼烧接种环是为了操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养避免接种环上可能存在的微生物污染

39、培养物；物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等在灼烧接

40、种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死答：以免接种环温度太高，杀死菌种。菌种。3.在作第二次以及其后的划线操在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，划线的末端开始，能使细菌的数目随能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法稀

41、释涂布平板法1.将分别盛有将分别盛有9mL水的水的6支试管灭菌，支试管灭菌，并按并按101106的顺序编号。的顺序编号。2.用移液管吸取用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。3.从从101倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注稀释液，注入入102倍稀释的试管中，重复第倍稀释的试管中，重复第2步的操作。步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。注意：注意：移液管需要经过灭菌。操作时，移

42、液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰试管口和移液管离火焰12cm处处.涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第2步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？问题讨论问题讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第菌操作要求，想一想，第2步应如何进行步应如何进行无菌操作？无菌操作？应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒

43、精灯与培养皿的距离要合适、吸例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。精灯火焰周围等等。问题讨论问题讨论微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养菌种的保存菌种的保存1.临时保藏临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后置养基，菌落长成后置于于4冰箱保存。冰箱保存。2.长期保存长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法本本课课题题知知识识小小结结四、课题成果评价四、课题成果评价 （一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培

44、养基在恒温箱中如果未接种的培养基在恒温箱中保温保温12 d后无菌落生长，说明培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新基的制备是成功的，否则需要重新制备。制备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。

45、求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养培养12 h与与24 h后的大肠杆菌菌落的后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。好的科学态度与习惯。例例1.关微生物营养物质的叙述中，正关微生物营养物质的叙述中，正 确的确的()A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C

46、.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量典例解析典例解析例例1.关微生物营养物质的叙述中，正关微生物营养物质的叙述中，正 确的确的()A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量典例解析典例解析D 解析：不同的微生物，所需营养物质解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于析。对于A、B选项，它的表达是不完

47、整选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于于C选项，除水以外的选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。则只能提供无

48、机盐。对于对于D选项，无机氮源提供能量的情况选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供可为硝化细菌提供能量和氮源。能量和氮源。例例2.下面对发酵工程中灭菌的理解下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是不正确的是()A.防止杂菌污染防止杂菌污染B.消灭杂菌消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前例例2.下面对发酵工程中灭菌的理解下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是不正确的是()A.防止杂菌污染防止杂菌污染B.消灭杂菌消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前灭

49、菌必须在接种前B 解析：灭菌是微生物发酵过程的一个解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用

50、的微生物是灭菌后质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g（NH4）2SO40.4gK2HPO44.0gMgSO49.25gFeSO40.5gCaCl20.5gH2O100ml例例3右表是某微右表是某微生物培养基成分，生物培养基成分，请据此回答：请据此回答：（1）右表培养基）右表培养基可培养的微生物类可培养的微生物类型是型是_.例例3右表是某微右表是某微生物培养基成分，生物培养基成分，请据此回答：请据此回答：（1）右表培养基