二章节基因工程酶学基础.ppt

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1、二章节基因工程酶学基础 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物功能基本概念及其生物功能特异水解断裂特异水解断裂RNA分子，分子，核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂特异水解断裂DNA分子，分子，脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为非专一性酶，底物或者为DNA或者为或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷

2、酸，叫从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内内切核酸酶切核酸酶 按水解断裂核酸分子的方式按水解断裂核酸分子的方式:根据作用的核酸底物不同根据作用的核酸底物不同:基因工程的操作，是在分子水平上的基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，如限制性核酸内切酶，连接酶，连接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等)作为工具对基因进行作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为酶称之为“工具酶

3、工具酶”。工具酶工具酶 1 1、限制、限制-修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。限制性核酸内切酶概念限制性核酸内切

4、酶概念2.2.性质性质内切酶内切酶主要来源于主要来源于原核生物原核生物即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5 5-P-P和和3 3-OH-OH末端末端 自我保护作用自我保护作用3.3.功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1.1.来源来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制大肠杆菌大肠杆菌B B大肠杆菌大肠杆菌K Kphage (B)phage (B)EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=1EOP

5、=1（修饰作用修饰作用）修饰的修饰的phage phage (K)(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的的寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰现象简称（简称（R/MR/M体系体系）。）。细菌的细菌的R/MR/M体系类似体系类似于免疫系统，能辨别自身的于免疫系统，能辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。寄主的限制与修饰现象寄主的限制与修饰现象E.O.P E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platingefficiency of pla

6、tingEOP=1EOP=1 限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNADNA进行分进行分解，解，切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）限制作用限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源DNADNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。，维护宿主遗传稳定的保护机制。细菌自身的细菌自身的DNADNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰所保甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2 2）修饰（）修饰（ModificationModificatio

7、n）Dam Dam甲基化酶甲基化酶(DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase)G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm Dcm甲基化酶甲基化酶(DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase)C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上位置上引入甲基引入甲基 修饰作用修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。身遗传物质和外来遗传物质的目的。（3 3）限

8、制与修饰系统相关的三个基因）限制与修饰系统相关的三个基因 hsd hsd R:R:编码限制性内切酶编码限制性内切酶 hsd hsd M:M:编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶 hsd hsd S:S:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别这类酶能识别DNADNA分子上的特定位点，并将双分子上的特定位点，并将双链链DNADNA切断切断这类酶使这类酶使DNADNA分子特定位点上的碱基甲基化，分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰即起修饰 DNA DNA的作用。的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。2.2

9、.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B株株 中，中，1 1）宿宿主主细细胞胞甲甲基基化化酶酶，将将染染色色体体DNADNA和和噬噬菌菌体体DNADNA特异性保护特异性保护.2 2）封封闭闭自自身身所所产产生生的的核核酸酸内内切切酶酶的的识识别别位位点点-（修饰）（修饰）1.1.大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B 株株 ，有各自的限制和，有各自的限制和修饰系统。修饰系统。限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制3.3.外外来来DNADNA入入侵侵时时，遭遭到到宿宿主主限限制制性性内内切切酶酶的的特特异异降降解解-（

10、限制）（限制）4.4.由由于于降降解解不不完完全全，外外来来少少数数DNADNA分分子子在在宿宿主主细细胞胞中中繁繁殖殖过过程程中中被被宿宿主主细细胞胞的的甲甲基基化化酶酶修修饰饰，虽虽然然是是外外来却不被降解。来却不被降解。5 5接接受受了了新新宿宿主主菌菌甲甲基基化化修修饰饰的的同同时时，丧丧失失了了原原宿宿主主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。1 1、限制、限制-修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3

11、 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.NathansD.Nathans提议的命名系统，提议的命名系统，命名原则如下：命名原则如下：限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名1.1.用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字母组成的头两个字母组成3 3个字母的略语表示个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物种名，组成酶的基

12、的物种名，组成酶的基本名称。本名称。大肠杆菌（大肠杆菌（E Escherichia scherichia cocolili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示2.2.如果酶存在于一种如果酶存在于一种特殊的菌株特殊的菌株中，则将该菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于位于噬菌体（病毒）或质粒噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。表示此染色体外遗

13、传成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 Eco EcoR R I I：抗药性：抗药性R R质粒质粒 3.3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序先后次序。如如HinHind d：d d菌株中发现的第菌株中发现的第二二个酶个酶4.4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称系统名称。限制性内切酶的系统命名为限制性内切酶的系统命名为R R，甲基化酶为，甲基化酶为M M。如如 R R.HinHind d 表示限制性内切

14、酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M M M M.HinHinHinHind d d d 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶实际应用中，实际应用中，实际应用中，实际应用中，R R R R常被省略。常被省略。常被省略。常被省略。EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第三个字母。第三个字母。目前鉴定出目前鉴定出四种不同类型四种不同类型的限制性内的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割切酶。据限制性核酸

15、内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为可分为、型。型。限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为饰酶活性，可分为、型。型。主要特性主要特性型型型型型型限制修限制修饰 蛋白蛋白结构构 辅助因子助因子 识别序列序列 切割位点切割位点双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源三聚体异源三聚体 ATP Mg2+SAM 距距识别序列序列1kb处 随机性切割随机性切割单一功能一功能 同源二聚

16、体同源二聚体 Mg2+4-6bp回文序列回文序列 识别序列内或附近序列内或附近特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源二聚体异源二聚体 ATP Mg2+距距识别序列下游序列下游24-26bp处 随机性切割随机性切割基因工程中使用注：注：SAM为为S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年从大肠杆菌年从大肠杆菌 B B株株和和 K K株株分离的。分离的。（1 1）识别位点序列）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基

17、本特性 如如 EcoEcoB B和和 EcoEcoK K。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一：表示任何一种核苷酸种核苷酸需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子辅助因子在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随随机机切开一条切开一条单链单链，不产生，不产生特异片断，特异片断，应用不大应用不大Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点切割位点 首先由首先由H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在在19701970年从流年从流感嗜血菌中分离出

18、来。感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind Hind 未甲基化修饰的双链未甲基化修饰的双链DNADNA上的特殊靶序列（多数是回上的特殊靶序列（多数是回文序列），与文序列），与DNADNA的来源无关。的来源无关。A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A 或或型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 （1 1）识别位点序列）识别位点序列 识别位点处。识别位点处。切开双链切开双链DNADNA。形成粘性末端（。形成粘性末端（sticky endsticky end）或平齐末端（或平齐末端（blunt endblunt end）。如

19、：）。如：EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平生平齐末端末端（2）切割位点切割位点A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA(DNA(识别识别位点下游位点下游24-26bp)24-26bp)，但，但不是不是对对称的回文称的回文顺顺序，且在序，且在识

20、别识别序列旁序列旁边边一定数目核苷酸一定数目核苷酸的位置切割。的位置切割。反反应应需要需要ATPATP、Mg Mg2+2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACC EcoP15:CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 IV型限制性内切酶型限制性内切酶 新新鉴鉴定定出出来来的的一一类类限限制制酶酶。只只切切割割碱碱基基已已被被甲甲基基化化、羟羟甲甲基基化化、葡葡糖糖羟羟甲甲基基化化的的DNA序列。序列。除除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。目前

21、尚无应用。核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性I型内切型内切酶酶II型内切型内切酶酶III型内切型内切酶酶内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构3种不同的种不同的亚亚基基单一成分单一成分2种不同的种不同的亚亚基基限制作用限制作用所需要的所需要的辅助因子辅助因子ATP、Mg2+和和SAMMg2+ATP、Mg2+和和SAM寄主特异寄主特异性位点识性位点识别序列别序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，回文序列，旋转对称旋转对称（IIs型除外）型除外）EcoP1:AGACC EcoP15:CAGCAG切割位点切割位点在距离识别位在

22、距离识别位点至少点至少1000 bp外随机切外随机切开一条单链。开一条单链。位于寄主位于寄主特异性位特异性位点或其附点或其附近近识别位点识别位点3端端24-26bp处处甲基化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异寄主特异性位点性位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行切割序列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割 不是不是是是不是不是基因工程中的用基因工程中的用途途无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大1 1、限制、限制-修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸

23、内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别序列识别序列 识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6 bp4-6 bp，少数识别更，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC EcoR CC

24、WGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 1 1、以以某某一一对对核核苷苷酸酸为为中中轴轴，左左右右同同数数目目的的核核苷苷酸酸彼此呈碱基互补。彼此呈碱基互补。2 2、这这两两股股DNADNA链链若若按按同同方方向向阅阅读读（如如5 5 3 3），其核苷酸顺序相同。其核苷酸顺序相同。5GAA TTC3 3CTT AAG5特点有二：特点有二：回文序列：反向重复序列，双链回文序列：反向重复序列，双链DNADNA中含有两个结中含有两个结构相同，方向相反的序列构相同，方向相反的序列 5GTNA

25、C3 3CANTG5限制性核酸内切酶切割双链限制性核酸内切酶切割双链DNADNA，水解，水解磷酸二酯键中磷酸二酯键中3 3 位酯键产生两个末端，末端位酯键产生两个末端，末端结构是结构是5 5-P-P和和3 3-OH-OH，产生，产生3 3种不同的切口。种不同的切口。切割方式切割方式 与与IIII型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端(cohesive ends):(cohesive ends):因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上不同（对称）酶切后形成的单链上不同（对称）酶切后形成的具有具有互补碱基互补碱基的的单链末端单链末端结构，酶切产结构，酶切产

26、生的两个粘性末端很生的两个粘性末端很容易容易通过互补碱基通过互补碱基的配对而的配对而重新连接重新连接起来。起来。平平 末末 端端(Blunt end):(Blunt end):因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上相同，酶切后形成的单链上相同，酶切后形成的平齐的末端平齐的末端结构，这种末端结构，这种末端不易不易重新连接起来。重新连接起来。1.51.5突出的末端突出的末端EcoRI等产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33

27、C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 52.32.3突出的末端突出的末端PstI等产生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G-P OH-A-C-G-T-C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5i i）不同的不同的DNADNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得

28、多。这比连接两个平齐末端容易得多。粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利iiii）同一个同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子环形分子。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。补平成平齐末端补平成平齐末端B 3B 3末端末端可以通过可以通过末端转移酶末端转移酶添加几个多聚核苷添加几个多聚核苷酸的尾巴（如酸的尾巴（如dAdA和和dTdT），即），即同聚物加尾同聚物加尾造成人工造成人工粘性末端。粘性末端。A A 5 5末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进

29、行进行3232P P标记。标记。末端标记末端标记3.3.平头末端平头末端PvuII等产生的平头末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5平齐末端的特点平齐末端的特点 连接困难，连接困难，连接效率低连接效率低，只有粘性末端连接效率的，只有粘性末端连接效率的1%1%，这种连接常出现，这种连接常出现多联体连接多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补

30、法：）添补法：利用利用DNADNA聚合酶聚合酶(klenow fragment）将碱基将碱基添补到目的基因的粘性末端上。添补到目的基因的粘性末端上。）削除）削除(平平)法法 利用利用S1S1和和BalBal3131等等核酸酶核酸酶将目的基因粘性末端的将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端单链突出部分削去，使其成为平齐末端不同来源的酶，不同来源的酶，识别相同的序列，识别相同的序列，切割方式相同或不同。切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同 如如HinHind d 和和HsuHsu I IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-

31、AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer)完全同裂酶：完全同裂酶：Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如XmaXma I I 和和 SmaSma I I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：识别的序列不同，但能识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端切出相同的粘性末端。如。如BamBamH IH I、BglBgl 、Bcl Bcl I I、XhoXho 等等5 5-G-GGGATCATCC-3C-3 3 3-CCT

32、AGCCTAGGG-5-5 BamBamH IH IBclBcl I I5 5-T-TGGATCATCA-3A-3 3 3-ACTAGACTAGT T-5-5 5 5-A AGATCGATCT-3T-3 3 3-TCTAGTCTAGA A-5-5 Bgl Bgl 5 5-U UGATCGATCY-3Y-3 3 3-Y-YCTAGCTAGU U-5-5 XhoXho U U代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后

33、形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A1 1、限制、限制-修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.1.

34、标准酶解体系的建立标准酶解体系的建立 一个单位（一个单位（U U）的限制性内切酶定义：）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中，在2020l l的反的反应应体系中，体系中，1h1h完全完全酶酶解解1 1gDNAgDNA所需要的酶量。所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（推荐：稍过量的酶（2-52-5倍）和较长的反应时间倍）和较长的反应时间 限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 2.2.酶解过程酶解过程 配酶解体系配酶解体系 混匀混匀 反应终止反应终止 酶解结果鉴定酶解结果鉴定 酶解体系酶解体系一般一般2020l l，保证酶液体积不超过反应总体积的，保证酶

35、液体积不超过反应总体积的10%10%前提下，尽量降低反应总体积。前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：加样顺序一般是：ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 大部分大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0-150 mMDTT1 mM0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 高盐酶高盐酶Volume20-100 mlTime Temp37 1-1.5 hr 混匀混匀移液枪吹打移液枪吹打或或手指轻弹管壁手指轻弹管壁若底物分子很

36、大（如基因组若底物分子很大（如基因组DNADNA），），应避免强烈振荡。应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。暂离心，使管壁液体全部下沉。反应终止反应终止三种方法：三种方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）至终浓度）至终浓度 10mmol/L;10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（加十二烷基硫酸钠（SDSSDS）至终浓度至终浓度0.1%(W/V)0.1%(W/V)）6565加热加热20min20min或者或者7070加热加热10min10min）酚）酚/氯仿氯仿抽提抽提 酶解结果鉴定酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶

37、电泳快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察观察然后决定是否终止反应然后决定是否终止反应限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 完全消化完全消化：内切酶在：内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。局部消化局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。：只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。达到局部消化的目的。酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的DNADNA条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带造成非特异性切割；造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正

38、确的操作，导致其它内切酶污染；底物底物DNADNA中可能存在其它中可能存在其它DNADNA污染。污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物底物DNADNA不纯；不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNADNA结合在一起使电结合在一起使电泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常 DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 一一般般采采取取 纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的

39、用量（510U酶酶/g DNA）延长保温时间延长保温时间（34h）扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（20 l）加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素 2.DNA2.DNA的甲基化程度的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：damdam甲基化甲基化酶酶（修（修饰饰G GA ATCTC中的中的A A）；）；dcmdcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGGCCA/TGG的的C C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶基因工

40、程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大大多数是多数是37，少数例外。，少数例外。酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度酶酶最适最适温度温度Apa Apa I I Bcl Bcl I I MaeMae II II TaqTaq I I30 30 50 50 50 50 6565Apy Apy I I BstBstE II E II MaeMae III III30 30 60 60 5555BanBan I I MaeMae I I SmaSma I I50 50 45 45 25253.3.温度温度

41、酶酶切切超超螺螺旋旋DNA分分子子，所所需需酶酶量量多多于于线线性性DNA分子；最高可达分子；最高可达20倍；倍；4.DNA分子的构型分子的构型 对对同同一一DNA分分子子上上不不同同位位置置的的识识别别序序列列，切割效率具有位点偏爱性；切割效率具有位点偏爱性；识别序列的侧面序列影响酶切效率。识别序列的侧面序列影响酶切效率。“保保 护护 碱碱 基基”是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。5.5.缓缓冲液冲液(Buffer)(Buffer)缓冲液的化学组成：缓冲液的化学组成：10XbufferMgClMgCl2 2、NaCl/KClNaCl/KCl：提供提供MgMg2+2+和离

42、子和离子强强度；度；Tris-HClTris-HCl：维维持持pHpH；二硫二硫苏苏糖醇（糖醇（DTTDTT）：）：防止防止酶酶的氧化，保持的氧化，保持酶酶稳稳定性；定性；牛牛血血清清白白蛋蛋白白BSABSA等等：提提高高溶溶液液中中蛋蛋白白质质的的浓浓度度，防防止止酶酶失活失活 ；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的即所谓的“星活性星活性”（star ac

43、tivity）现象。现象。EcoRI*代表代表EcoRI的星号活力。的星号活力。星活性的特点星活性的特点:限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低 商品化的限制商品化的限制酶一般都一般都带有有专用用缓冲液。冲液。EcoR I 和和BamH I 等都有等都有*活性。活性。EcoR I*在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！概括起来，诱发星活性的因素有如下几种概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：（1 1）高甘油含量（）高甘油含量（55,v,vv v）；）

44、；（2 2）限制性内切核酸酶用量过高（）限制性内切核酸酶用量过高（100U100UugDNAugDNA）；）；（3 3）低离子浓度（）低离子浓度（25 mmol25 mmolL L）；）；（4 4）高）高pHpH（8.08.0以上）；以上）；（5 5）含有机溶剂，如）含有机溶剂，如DMSODMSO（二甲基亚砜（二甲基亚砜 ），乙醇），乙醇等；等；（6 6）有非）有非MgMg2+2+的二价阳离子存在（如的二价阳离子存在（如MnMn2+2+，CuCu2+2+，CoCo2+2+，ZnZn2+2+等）。等）。但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（1g1g加加25U25

45、U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量不能过分加大酶的用量酶过量对酶切反应的影响：酶过量对酶切反应的影响：1 1）酶酶过过量量（一一般般为为100U/gDNA100U/gDNA）会会影影响响识识别别序序列列的的正正确确性性，如如：BamBamHI HI 的的正正常常识识别别序序列列:GGATTC GGATTC ；酶过量识别序列；酶过量识别序列 NGATCN NGATCN2 2）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。响其识别的专一性，诱发星号活力

46、。6.酶对消化效率的影响酶对消化效率的影响1U1U核核酸酸内内切切酶酶的的酶酶活活性性：在在最最佳佳反反应应条条件件下下1h1h，完全水解，完全水解1gDNA1gDNA所需的酶量所需的酶量1 1、限制、限制-修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性内切酶对限制性内切酶对DNA的消化的消化1.1.内

47、切内切酶酶与与识别识别序列的序列的结结合模式合模式 1986年年J.A.McClarin等通过等通过X射线晶体衍射发现射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以型限制性内切酶是以同型二聚体同型二聚体的形式与靶序列的形式与靶序列结合。结合。GAATTCCTTAAG2.2.双双酶酶切消化切消化 两种不同的限制酶切割同一种两种不同的限制酶切割同一种DNA分子分子-构建载体。构建载体。对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用两种酶均适用的缓冲液，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。低温酶先切，然后升温，加入高温酶再切

48、双酶切反应体系内切酶在内切酶在DNADNA上的上的所有所有识别位点都被切开识别位点都被切开12 341234 3 3 完全消化完全消化DNADNA分子的分子的G+CG+C含量含量为为50%50%，而且，而且4 4种碱基的分布是随机的。种碱基的分布是随机的。最最终终片段大小是片段大小是4 4n nbpbp只有有限数量的酶切位点被切开只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。12 3414 4 4 局部消化局部消化限制性核酸内切酶的应用：限制性核酸内切酶的应用：

49、重组重组DNA前的切割前的切割 构建新质粒构建新质粒 构建物理图谱构建物理图谱 DNA分子杂交分子杂交 用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNA 制备制备DNA探针探针 亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析 基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究本本节重点掌握的内容重点掌握的内容 1、限制性核酸内切、限制性核酸内切酶、同裂、同裂酶、同尾、同尾酶、星星活性。、星星活性。2、II型限制性核酸内切型限制性核酸内切酶命名原命名原则、操作注意事、操作注意事项及及产生星活性的原因、影响生星活性的原因、影响酶活性的因素。活性的因素。第二章第二章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 DNA DNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶第四节第四节 DNA DNA修饰酶修饰酶第五节第五节 外切核酸酶外切核酸酶第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶第七节第七节 RNA RNA酶酶