专题五1DNA粗提取与鉴定知识讲解.ppt

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1、专题五1DNA粗提取与鉴定实验用具：实验用具：铁架台；铁环；镊子；三铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml100ml，一，一个）；烧杯；（个）；烧杯；（100ml100ml，一个，一个，50ml50ml、500ml500ml各二个）；试管（各二个）；试管（20ml20ml，二个）；，二个）；漏斗；试管夹；纱布。漏斗；试管夹；纱布。二、二、DNADNA的粗提取与鉴定的实验设计的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 材料：新鲜的鸡血材料：新鲜的鸡血注意：注意：本实验中

2、，本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸柠檬酸钠溶液钠溶液）原则上只要含原则上只要含DNADNA的生物材料都可以，但的生物材料都可以，但是选取是选取DNADNA含量相对较高的生物组织，成含量相对较高的生物组织，成功率更大。功率更大。(1)(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、破碎细胞、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血

3、细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？利用了什么原理？2 2、过滤，获取含、过滤，获取含DNADNA的滤液的滤液讨论：为什么反复地溶解与析出讨论：为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去，能够去除杂质除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出复溶解与析出DNADNA，就能够除去与，就能够除去与DNADNA溶解度溶解度不同的多种杂质不同的

4、多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三利用的是与蛋白质分开；方案三利用的是DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与白质变性，与DNADNA分离分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNADNA的稳定性。的稳定性。（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷

5、却的酒冷却的酒精溶液（体积分数为精溶液（体积分数为9595），静置，静置2-3min2-3min，溶，溶液中会出现液中会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用玻璃棒沿用玻璃棒沿一个方向一个方向搅拌，卷起丝状物，并用搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水滤纸吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出2 2、DNA DNA的鉴定的鉴定鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，其中一于两只试管中，其中一只加入只加入DNADNA丝状物，各加入丝状物

6、，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,5min,待试待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有看溶解有DNADNA的溶液是否有的溶液是否有蓝色蓝色（一）案例一：以鸡血为实验材料进行（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNADNA的的粗提取粗提取三、实验案例三、实验案例鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长较高，操作繁琐，

7、历时较长1 1、鸡血细胞做实验材料的原因、鸡血细胞做实验材料的原因鸡血细胞核的鸡血细胞核的DNADNA含量丰富，材料易得含量丰富，材料易得2 2、实验原理、实验原理 DNA DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的的浓度的变化而改变的。当浓度的变化而改变的。当NaClNaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度最低。利用这一原的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在理，可以使溶解在NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出。析出。DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋不

8、溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的一步提取出含杂质较少的DNADNA。DNA DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。4 4、课前准备鸡血细胞液、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为取质量浓度为0 01g/ml1g/ml的的柠檬酸纳溶液（抗凝柠檬酸纳溶液（抗凝剂）剂）100ml100ml，置于，置于500ml500ml烧杯中。注入新鲜的烧杯中。注入新鲜的鸡血（约鸡血（约180ml180ml），同时

9、用玻璃棒搅拌，使血），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min1000r/min（转每分）的离心机离心（转每分）的离心机离心2min2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）液。）过程过程柠檬酸钠作用柠檬酸钠作用防止血液凝固防

10、止血液凝固作用机理作用机理柠檬酸钠能与血浆中的柠檬酸钠能与血浆中的CaCa2+2+发生反应，生成柠发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的檬酸钙络合物，血浆中游离的CaCa2+2+大大减少，大大减少，血液就不会凝固血液就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的DNADNA，容易被玻璃，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNADNA的的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液液注意事项注意事项讨论：提取鸡血中的讨论：提取鸡血中的DNADNA时，为什么除去血液时，为什么除去血液中的上清液？中

11、的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5 5、方法步骤、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液将制备好的鸡血细胞液5 mL5 mL10mL10mL，注入到，注入到50 mL50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL20 mL，同时用同时用玻璃棒玻璃棒充分搅拌充分搅拌5 min5 min，使血细胞加速使血细胞加速破裂。破裂。然后，用放有然后，用放有纱布的漏斗纱布的漏斗将血细胞液过将血细胞液过滤至滤至500mL500mL。取其滤液。取其滤液。提取鸡血细胞的细

12、胞核物质提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破会吸水以至胀破（1 1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？会有什么变化？（2 2）用玻璃棒搅拌有什么意义？）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎太快太猛，防止打碎DNADNA（3 3）滤去的是什么物质？）滤去的是什么物质？得到的是什么？得到的

13、是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNADNA溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA将氯化钠的物质的量浓度为将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol 2 mol的溶的溶40mL40mL加入到滤液中，并用加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌玻璃棒沿一个方向搅拌1min1min，使其混合均匀，这时，使其混合均匀，这时DNADNA在溶液中呈溶在溶液中呈溶解状态解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停玻璃棒不停地轻轻搅拌，地轻轻搅拌，这时烧杯中有

14、丝状物出现，注意观这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于浓度相当于0.14 mol0.14 molL L）析出含析出含DNADNA的粘稠物的粘稠物滤取含滤取含DNADNA的粘稠物的粘稠物用放有用放有多层纱布多层纱布的漏斗，过滤步骤的漏斗，过滤步骤3 3中的溶液中的溶液至至 500mL 500mL的烧杯中，含的烧杯中，含 DNA DNA的的粘稠物

15、被留在粘稠物被留在纱布上纱布上将将DNADNA的粘稠物再溶解的粘稠物再溶解取取 1 1个个 50 mL 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为质的量浓度为 2 mol 2 molL L的溶液的溶液 20mL 20mL。用钝头。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻用玻璃择不停地搅拌，璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中液中过滤含有过滤含有DNADNA的氯化钠溶液的氯化钠溶液取取1 1个个100 mL100 mL烧杯，用放有烧杯，用放有两层纱布两层纱布的漏斗的漏斗过滤步骤过

16、滤步骤5 5中的溶液。取其滤液，中的溶液。取其滤液，DNADNA溶于溶于滤液中滤液中提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA在上述滤过的溶液中，加入在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积冷却的、酒精的体积分数为分数为 95 95的溶液的溶液 50mL 50mL（使用冷却的酒精，（使用冷却的酒精，对对DNADNA的凝集效果较佳），并用的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是状物的主要成分就是DNAD

17、NA答：因为答：因为DNADNA不溶于冷酒精，而其他物质可以不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的溶解在酒精中，使含杂质较少的DNADNA丝状物可丝状物可以析出以析出,悬浮于溶液中悬浮于溶液中讨论：讨论：（2 2）观察丝状物呈什么颜色？）观察丝状物呈什么颜色？答：白色答：白色（1 1）为什么要加）为什么要加50mL50mL的冷酒精？的冷酒精？取两支取两支20 mL20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为浓度为0 0015 mol015 molL L的溶液的溶液5 mL5 mL，将丝状物，将丝状物放入其中一支试管中，放入其中一支试管中，用玻璃

18、棒搅拌，用玻璃棒搅拌，使丝状物使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL4mlL的二苯的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 5 minmin，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化溶液颜色的变化 DNA DNA的鉴定的鉴定讨论：讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色原来颜色（2 2）这一鉴定结果说明什么问题？）这一鉴定结果说明什么问题？（1 1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？）比较两个试管中溶液的

19、颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是答：提取出的丝状物是DNADNA（3 3）DNA DNA的直径约为的直径约为20102010-10-10 m m，实验中出，实验中出现的丝状物的粗细是否表示现的丝状物的粗细是否表示1 1个个DNADNA分子直径的分子直径的大小？大小？答：答：DNA DNA分子直径只有分子直径只有2 nm2 nm。丝状物是多。丝状物是多个个DNADNA子聚在一起形成的子聚在一起形成的 答答：整整个个实实验验共共“两两次次蒸蒸馏馏水水，三三次次过过滤滤，两两次析出，六次搅拌次析出，六次搅拌”6 6、讨论：、讨论：两次蒸馏水两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第一次：细胞吸水胀破 第一

20、步第一步第二次：使第二次：使 DNA DNA黏稠物析出黏稠物析出 第三步第三步（1 1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？过过滤滤时时使使用用的的纱纱布布层层数数与与需需用用滤滤液液或或黏黏稠稠物物有有关关，第第二二次次要要用用其其滤滤出出的的黏黏稠稠物物有有关关，所所以以要要使使用用多多层层纱纱布布，第第一一次次和和第第三三次次均均要要用用其其滤滤液液，使用的纱布为使用的纱布为1 12 2层层三次过滤三次过滤第一次：第一次：DNA DNA存在于滤液里存在于滤液里 第一步第一步第

21、二次：第二次：DNA DNA被留在纱布上被留在纱布上 第四步第四步第三次：第三次：DNA DNA存在于滤液里存在于滤液里 第六步第六步两次析出两次析出第一次：用第一次：用0.14 mol0.14 molL L 的的NaCINaCI溶液含杂质多溶液含杂质多第三步第三步第二次：用冷却的第二次：用冷却的9595的酒精的酒精第七步第七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步六次搅拌：第一、二、三、五、七步其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的插烧杯底部，这样

22、才能保证得到完整的DNADNA（2 2）为什么反复地溶解与析出）为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去，能够去除杂质？除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出反复溶解与析出DNADNA，就能够除去与，就能够除去与DNADNA溶解溶解度不同的多种杂质度不同的多种杂质1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（檬酸钠的目的

23、是（）A.防止凝血防止凝血 B.加快加快DNA析出析出C.加快加快DNA溶解溶解 D.加速凝血加速凝血A A 2、DNA的溶解度最低时，的溶解度最低时，NaCl的物质的物质的量浓度为（的量浓度为（）A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l3、在向溶解、在向溶解DNA的的NaCl溶液中，不断溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（加入蒸馏水的目的是（）A 加快加快DNA溶解的速度溶解的速度B 加快溶解杂质的速度加快溶解杂质的速度C 减小减小DNA的溶解度，加快的溶解度，加快DNA析出析出D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出减小杂质的溶解度，加快杂质的析出C

24、C C C 4、向溶有、向溶有DNA的的2mol/L的的NaCl溶液中不溶液中不断加入蒸馏水断加入蒸馏水,在这个过程中在这个过程中DNA的溶解的溶解度变化情况分别是度变化情况分别是A 减小减小;减小减小 B 增大增大;增大增大C 先减小后增大先减小后增大 D增大增大;减小减小5、欲使溶有、欲使溶有DNA的的2mol/L的的NaCl溶液中溶液中的的DNA析出，最有效的办法是析出，最有效的办法是A 加蒸馏水加蒸馏水 B 加矿泉水加矿泉水C 加清水加清水 D 加生理盐水加生理盐水6、与析出、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是粘稠物有关的叙述，不正确的是A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低操作时缓慢滴

25、加蒸馏水，降低DNA的溶解度的溶解度B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整分子的完整C 加蒸馏水可以同时降低加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度和蛋白质的溶解度D 当丝状粘稠物不再增加时，当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可溶液的浓度可以认为是以认为是0.14mol/L7、你能采用其他方法对、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？进行鉴定吗？用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴）遇二苯胺会染成（沸水浴）A 硅红色硅红色 B 红色红色 C 紫色紫色 D 蓝色蓝色D D 此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢