SN∕T 5366.1-2022 商品化试剂盒检测方法 肠杆菌科计数 方法一.pdf

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1、I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 6.12 0 2 2 商品化试剂盒检测方法 肠杆菌科计数 方法一C o mm e r c i a l k i t m e t h o dE n t e r o b a c t e r i a c e a e c o u n tT e s t m e t h o d 2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是

2、S N/T 5 3 6 6 商品化试剂盒检测方法 肠杆菌科计数 的第1部分。S N/T 5 3 6 6已经发布了以下部分:第1部分:商品化试剂盒检测方法 肠杆菌科计数 方法一。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:曾静、张西萌、付溥博、魏海燕、魏咏新、郑晶。S N/T5 3 6 6.12 0 2 2商品化试剂盒检测方法肠杆菌科计数 方法一1 范围 本文件规定了食品中肠杆菌科计数(3 M P e t r i f i l mTM E n

3、t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t)的检测方法。本文件适用于食品中肠杆菌科计数。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.4 12 0 1 6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 S N/T 2 7 7 5 商品化食品检测试剂盒评价方法 S

4、 N/T 3 2 6 6 食品微生物检验方法确认技术规范3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测肠杆菌科。所有培养物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9中的有关规定执行。5 技术概要 肠杆菌科测试片(3 M P e t r i f i l mTM E n t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t)是一种预先制备好的培养基系统,含有标准的培养基和指示剂。肠杆菌科细菌在测试片培养基上的表现为:红色菌落无黄色晕圈、有气泡,红色菌落有黄色晕圈、无气泡,红色菌落有黄色晕圈

5、、有气泡,以上3种情况均为肠杆菌科细菌典型菌落。6 试剂 除有特殊说明外,所有实验室用试剂均为分析纯,实验用水符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规定。6.1 肠杆菌科测试片(3 M P e t r i f i l mTM E n t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t)测试片储存于2 8,有效期为1 8个月,在使用前应将测试片温度平衡至室温。1S N/T5 3 6 6.12 0 2 2本标准使用的肠杆菌科测试片由3 M有限公司生产,参考S N/T 2 7 7 5和S N/T 3 2 6 6对测试片进行技术性评价。具体评价结果参见附录B。注:如肠

6、杆菌科测试片关键技术指标发生变动时,以测试片说明书操作为准。6.2 缓冲蛋白胨水(B PW)配制方法按照附录A。6.3 1 m o l/L氢氧化钠(N a O H)称取 4 0 g N a OH 溶于1 0 0 0 mL蒸馏水中。6.4 1 m o l/L 盐酸(H C l)移取浓盐酸 9 0 mL,用蒸馏水稀释到1 0 0 0 mL。7 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:a)恒温培养箱:3 6 1;b)冰箱:2 5;c)天平:感量0.1 g;d)均质器;e)漩涡混匀器;f)无菌移液管:1 mL(具0.0 1 mL刻度)、1 0 mL(具0.1 mL刻度)或微量

7、移液器及吸头;g)无菌锥形瓶或等效容器:容量5 0 0 mL;h)无菌试管:1 8 mm1 8 0 mm;i)p H计或精密p H试纸。8 检测程序 肠杆菌科测试片(3 M P e t r i f i l mTM E n t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t)检测程序见图1。2S N/T5 3 6 6.12 0 2 2图1 肠杆菌科测试片(3 M P e t r i f i l mT M E n t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t)检测程序9 操作步骤9.1 样品稀释9.1.1 固体和半固体样品:称取

8、2 5 g样品放入盛有2 2 5 mL B PW的无菌均质杯中,以8 0 0 0 r/m i n1 0 0 0 0 r/m i n均质1 m i n2 m i n,或放入盛有2 2 5 mL B PW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 m i n 2 m i n,制成11 0的样品匀液。9.1.2 液体样品:以无菌移液管吸取2 5 mL样品放入盛有2 2 5 mL B PW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成11 0的样品匀液。9.1.3 样品匀液的p H值应在6.57.5之间,必要时用1 m o l/L N a OH或1 m o l/L HC l调节p H值。9.

9、1.4 用1 mL无菌移液管或用1 mL微量移液器吸取11 0样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入盛有9 m L B PW的无菌试管中(注意移液管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管,或使用漩涡混匀器,使其混合均匀,制成11 0 0的样品匀液。9.1.5 按9.1.4 操作程序,依次制成1 0倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1 mL无菌移液管或微量移液器吸头。从制备样品稀释液到样品接种完毕,全过程不得超过1 5 m i n。9.2 接种 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计,选择2个3个适宜连续稀释度进行接种。将肠杆菌科测试片置于平坦表面,揭开上层膜,用无菌移液管或微量移液

10、器吸取样品匀液1 mL,垂直加在肠杆菌科测试片的中央,将上层膜盖下,将压板放置在上层膜中央处,轻轻按压,切勿扭转压板,使样品匀液均匀覆盖于圆形压板面积内,拿起压板,静置1 m i n。每个稀释度接种两张肠杆菌科测试片。同时,吸取1 m L空白稀释液加入肠杆菌科测试片,作为空白对照。3S N/T5 3 6 6.12 0 2 29.3 培养 将肠杆菌科测试片正面向上、水平置于培养箱内,于3 6 1 条件下培养2 4 h2 h。测试片最多可堆叠至2 0片。9.4 典型菌落计数9.4.1 肠杆菌科细菌在测试片上的典型菌落为:1)红色菌落无黄色晕圈、有气泡;2)红色菌落有黄色晕圈、无气泡;3)红色菌落有

11、黄色晕圈、有气泡。选取菌落数在1 5 C F U1 5 0 C F U 之间,无蔓延生长的测试片进行计数,计数以上3种典型菌落。菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y f o r m i n g u n i t s,C F U)表示。9.4.2 当细菌浓度很高时,背景颜色变浅,有很多小菌落或很多小气泡。结果记录为“多不可计”或者T NT C(t o o n u m e r o u s t o c o u n t,TNT C)。9.4.3 某些种类的微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计数未液化的面积来估算菌落浓度。9.4.4 当菌落数量过多、计数困

12、难时,可选择几个有代表性的小方格,计算平均菌落数,再乘以2 0,即可得到整个测试片估算的菌落数(圆形生长面积为2 0 c m2)。例如,计数2个小方格的菌落数,求平均,再乘以2 0即为1个测试片的计数结果。1 0 结果计算1 0.1 若只有一个稀释度测试片上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个测试片菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每 g(mL)样品中肠杆菌科菌落总数结果。1 0.2 若有两个连续稀释度的测试片菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=C(n1+0.1n2)d(1)式中:N 样品中菌落数;C 测试片(含适宜范围菌落数的测试片)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释

13、倍数)测试片个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)测试片个数;d 稀释因子(第一稀释度)。1 0.3 若所有稀释度的测试片上菌落数均大于1 5 0 C F U,则对稀释度最高的测试片进行计数,其他测试片可记录为“多不可计”,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。1 0.4 若所有稀释度的测试片上菌落数均小于1 5 C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1 0.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)测试片均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。1 0.6 若所有稀释度的测试片上菌落数均不在1 5 C F U1 5 0 C F U 之间,其中一部分小于1 5 C F U或大于

14、1 5 0 C F U 时,则以最接近1 5 C F U或1 5 0 C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1 1 结果的表述1 1.1 菌落数小于1 0 0 C F U时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。1 1.2 菌落数大于或等于1 0 0 C F U时,第3位数采用“四舍五入”原则,修约后,取前2位数字,后面用 04S N/T5 3 6 6.12 0 2 2代替位数;也可用1 0的指数形式来表示,按“四舍五入”原则,修约后,取两位有效数字。1 1.3 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。1 1.4 称重取样以 C F U/g 为单位报告,体积取样以 C F U/mL 为单位

15、报告。5S N/T5 3 6 6.12 0 2 2附 录 A(规范性)培养基和试剂 缓冲蛋白胨水(B PW)的成分和制法如下:a)成分蛋白胨 1 0.0 g氯化钠5.0 g磷酸氢二钠3.5 g磷酸二氢钾1.5 g蒸馏水1 0 0 0.0 mLb)制法将a)的成分加热溶解,于2 5 时调节p H 至7.20.2,分装于5 0 0 mL适当容器中,每瓶2 2 5 mL,于1 2 1 高压灭菌1 5 m i n。6S N/T5 3 6 6.12 0 2 2附 录 B(资料性)肠杆菌科测试片(3 M P e t r i f i l mT M E n t e r o b a c t e r i a c

16、e a e C o u n t P l a t e)评价结果1)1)本评价结果仅适用于3M公司生产的肠杆菌科测试片(3M P e t r i f i l mTM E n t e r o b a c t e r i a c e a e C o u n t P l a t e)。B.1 线性和准确度B.1.1 表B.1给出了测试片方法和参考方法(G B 4 7 8 9.4 12 0 1 6)的线性关系。表B.1 测试片方法和参考方法(G B 4 7 8 9.4 12 0 1 6)的线性关系食品种类食品基体线性方程相关系数(R2)T检验值肉制品猪肉馅y=0.2 8 2 7x+1.6 0 4 70.9

17、 8 6 40.7 4 2牛肉馅y=1.0 8 6 7x-0.5 1 5 40.9 9 8 30.3 2 6鱼类和海产品金枪鱼y=1.0 8 2 5x-0.2 6 0 80.9 8 5 30.5 8 9白虾y=1.1 0 4 3x-0.3 1 0 90.9 8 8 90.0 9 1杂品胡椒粉y=1.2 2 1 6x-0.7 6 5 10.9 8 4 80.8 0 6小米y=0.8 7 9 6x+0.4 1 2 50.7 8 8 40.4 7 1乳制品奶酪y=0.2 8 3 8x+4.1 6 20.9 9 3 20.5 1 5奶酪片y=1.0 3 9 8x-0.1 7 40.9 5 9 80.4

18、 9 3家禽类鸡心y=1.0 1 7 3x-0.0 5 6 70.9 9 9 80.3 0 8鸡肝y=0.8 6 0 3x+0.6 2 4 80.9 1 8 70.9 8 4B.1.2 表B.2给出了5类食品的线性关系。表B.2 5类食品的线性关系食品种类l o g值范围线性方程相关系数(R2)肉制品2.0 04.7 0y=0.9 3 0 5x+0.1 6 8 90.9 9 4 5鱼类和海产品2.4 83.5 1y=1.1 1 3 3x-0.3 4 30.9 9 7 9杂品3.4 24.2 2y=0.9 5 5 4x+0.1 6 1 60.9 8 8 6乳制品5.1 95.8 0y=0.9 4

19、 2 5x+0.3 3 5 50.9 9 3 8家禽类4.1 14.9 6y=1.0 0 8 5x-0.0 2 7 90.9 9 5 3B.2 耐变性 选用两个污染水平对培养基温度和培养时间两个变量进行耐变性实验,经验证,培养温度选择3 4 和3 6,培养时间选择2 2 h和2 6 h,对检测结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别,说明耐变性实验结果无明显差异,见表B.3。S N/T5 3 6 6.12 0 2 2S N/T 表B.3 耐变性实验结果实验条件菌株添加水平测试结果(L OG值)12345平均值sr3 6,2 6 h高浓度3.2 63.3 23.3 63.3 83

20、.4 03.3 40.0 5 6低浓度1.2 31.3 21.2 31.4 11.2 01.2 80.0 8 63 6,2 2 h高浓度3.3 63.3 23.2 03.4 13.2 33.3 00.0 8 8低浓度1.2 81.1 51.3 21.0 41.4 11.2 40.1 4 63 4,2 6 h高浓度3.3 43.3 83.3 43.2 33.3 23.3 20.0 5 6低浓度1.3 01.3 21.3 41.2 81.3 61.3 20.0 3 23 4,2 2 h高浓度3.3 43.3 03.2 63.4 03.0 43.2 70.1 3 8低浓度1.3 21.3 81.2

21、61.2 61.2 61.3 00.0 5 4B.3 批间变异 取3个不同批号测试片对两个污染浓度奶粉样品进行批间变异实验,3个不同批号测试片测试结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别,说明不同批号产品无明显差异,见表B.4。表B.4 批间变异实验结果菌株浓度批号测试结果(L OG值)12345M e a nsrR S D/%高浓度2 0 1 8-0 3 K C3.3 63.3 03.3 63.3 63.4 03.3 5 60.0 3 5 7 81.0 7%2 0 1 8-0 7 K B3.4 03.3 83.5 13.2 33.4 03.3 8 40.1 0 0 12.9 6%2 0 1 8-0 4 K D3.2 33.4 63.2 33.4 03.3 03.3 2 40.1 0 3 13.1 0%低浓度2 0 1 8-0 3 K C1.2 61.4 11.2 81.4 81.4 01.3 6 60.0 9 3 1 76.8 2%2 0 1 8-0 7 K B1.4 91.2 61.2 81.2 81.4 91.3 60.1 1 98.7 5%2 0 1 8-0 4 K D1.3 61.4 11.2 01.1 51.4 01.3 0 40.1 2 0 59.2 4%T/NS