SN∕T 5528-2022 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS 65.020.20CCS B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 55282022大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Bai ley stripe mosaic virus2022-07-07 发布 2023-02-01 实施中华人民共和国海关总署 发布SN/T 55282022.t/.刖 百本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、广东杰信检验认证有限公司、中华人民共和国上

2、海 海关。本文件主要起草人：冯黎霞、魏霜、李献锋、于璇、武目涛、赵立荣、黄璐、于翠、杨翠云。ISN/T 55282022大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法1范围本文件规定了大麦条纹花叶病毒DAS-ELISA、普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检疫鉴定方法。本文件适用于籽粒、花粉、种苗及其他植物产品中大麦条纹花叶病毒的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 2122进出境

3、植物及植物产品检疫抽样方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4大麦条纹花叶病毒基本信息学名：Barley stripe mosaic virus o异名：Barley false stripe virus.Barley mild stripe virus.Barley mild stripe mosaic virus.Barley mosaic virus,Barley stripe mosaic hordeivirus.Oat stripe mosaic virus。缩写：BSMV。分类地位：RNA病毒域(R也oviria),正RNA病毒界(Ortoravae),黄病毒门(Kit

4、rfnovUo-fa).甲型超群病毒纲(.Alsuviricetes).马泰利病毒目(.Martellivirales)，植物杆状病毒科(Wrgaviri-dae),大麦病毒属(Hordeivirus)大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录Ao5方法原理大麦条纹花叶病毒的血清学和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的 特异性反应.对植物样品进行双抗体夹心免疫酱联吸附测定(DAS-E1.ISA)；根据BSMV的基因组特征 建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。6仪器用具与试剂6.1仪器微量天平、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱(4()、超低温冰箱、高压灭菌锅、p

5、H计、超1S7T 55282022净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪。6.2用具移液器（最大量度分别为1 000 piL、200 fxL、100,uL、10 piL、2.5 ptL）、酶联板、离心管（1.5 ml,、0.2 ml.）、研磨用具（研钵研杵或小型料理机）。6.3 主要试剂除另有规定外.所有试剂均为分析纯.实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-EI.ISA试剂详见附录B。RT-PCR检测试剂详见附录C实时荧光RT-PCR检测试剂详见附录Do7制备检测样品7.1籽粒7.1.1 直接制备籽粒抽样按照SN/T 2122的规定执行。根据

6、S8联免疫测定和分子生物学检测不同的样品制备需求.随机取样或者挑选畸形、生长不成熟的 籽粒直接制备检测样品。7.1.2育苗取样随机取样或挑选外观不正常的籽粒播撒在铺有无菌滤纸的培养盘中培养过程中滤纸需一直保持 湿润状态.或将挑选的籽粒浸泡萌芽后播种在无菌土中.培养观察。待长出完全舒展的叶片后.将表现 有BSMV疑似症状的植株单独编号.未表现BSMV疑似症状的植株分组（1020株为1组）并编号.根 据需要分别用于酶联免疫测定和分子生物学检测。7.2 种苗有症状（如叶片花叶、条斑、坏死等）的植株.每个植株进行单独编号检测。无症状植株分组并编号 后进行检测，分组和检测方法参照7.1.2。7.3 其他

7、植物产品无症状或无法观察症状的其他植物产品，参照SN/T 2122中规定的抽样方法进行抽样.分组编号 方法和检测方法参照7.1.2。8检测鉴定8.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）将制备的样品上清液加入包被有BSMV抗体的酶联板中.进行DAS-ELISA检测.每个样品至少 设置1个重复，健康的植物组织作为阴性对照感染有BSMV的植物组织作为阳性对照.样品提取缓 冲液作为空白对照其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品一致。具体操作详见 附录B。2SN/T 552820228.2 R I-PCR 检测RT-PCR检测的阴性对照、阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空

8、白对照。分别提取样品和对照 的总RA,反转录合成cD、A后进行PCR检测.具体操作详见附录C。也可以使用商品化RT-PCR-步法试剂盒进行检测。8.3 序列测定RT-PCR产物回收后进行序列测定.并将测定的序列与已知的BSMV序列进行比对分析。8.4 实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阴性对照、阳性对照和空白对照设置同8.2。分别提取样品和对照的总 RA,反转录合成cDA后进行PCR检测.具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒.则按照 试剂盒说明进行。9结果判定当检测出现以下结果时.则判定为BSMV检出.否则判定为BSMV未检出：一当DAS-ELISA、RT-PCR、实时荧

9、光RT-PCR3种检测方法中有两种及两种以上的检测结果呈 阳性；当RT-PCR检测结果为阳性.且测序结果证实其同源性符合BSMV同种间同源性要求。10样品保存10.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后，未检出BSMV的样品应置于适合的条件下妥善保存3个月。检出 BSMV的样品至少保存6个月.或保存至索赔有效期满，以备复核.保存期满后应经高压灭菌后方可 处理。10.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的报关单号、委托单位、名称、数（重，量、产地、接收时间、检测时间、方法 和结果等.并要有检测人员和审核人员签字。DA$-E1JSA检测应有酶联反应的原始数据.RT-PCR检 测应有电泳图

10、片.序列测定应有所测定序列的相关文件.实时荧光R T-PC R检测应有荧光曲线图谱。11结果复核检验结果的复核由海关总署指定单位和人员进行.主要考察实验记录、电泳照片、测定序列信息和 荧光曲线图谱等资料的完整性和真实性.必要时进行复核实验。3S7T 55282022附录 A（资料性）大麦条纹花叶病毒其他信息A.1寄主范围BSMV 自然寄主为大麦、小麦 Triticum ae2?、燕麦 Avena sativa、玉米 Zeamays等禾本科植物。人工接种也可侵染甜菜Beta uulgaris、藜麦Chenopodium quinoa、藜Chenopodium album Chenopodium

11、Zega/e”se、烟草 Nicotiana tabacum,zK Oryza sativa、糜子 Panic uin miliaceum、黑麦 Secale cereale、高粱 Sorghum bicolor、菠菜 Spinacia oleracea 等。A.2 危害症状感染该病毒后大麦和小麦出现的症状均比较复杂.因品种和外界环境等因素的不同而影响症状的 出现与否、症状类型变化及发病严重度等。病株所结种子不饱满.千粒重有不同程度的降低。典型感病 症状表现为叶片褪绿斑驳.深绿和浅绿相间的不规则条纹,黄色花叶或坏死斑块.整张叶片变成黄白色。大麦叶片会出现分散的褐色细小斑点严重的则引起叶片枯死。

12、图A.1 BSMV在大麦上的危害症状（引自Ihomas W.1984）A.3 分布地区主要分布国家和地区有美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚、英国、德国、法国、丹麦、波兰、前南斯拉夫、罗马尼亚、俄罗斯、埃及、土耳其、也门、巴基斯坦、日本、韩国。在中国新疆曾大面积流行过目前在中国 小麦产区局部有分布。A.4传播方式病毒主要通过种子、花粉和机械传播.种子传播能力与病毒株系、感染植物所处的生理周期以及温 度有关。A.5粒体形态病毒粒体为螺旋直杆状.直径约为20 nm.长度为110 nm-160 nm.螺旋对称.螺距为2.5 nm。4SN/T 55282022A.6 基因组该病毒基因组为线性正单链RA,分

13、为3个片段a、B、y.a大小为3.7 3.9 kb,3为3.13.6 kb.1为2.63.2 kb.基因组编码7个蛋白质,分别为aa、Ba、Bb、Bc、Rd、ya、yb。外壳蛋白的基因组位于 RNA B 的 5端。5S7T 55282022附录 B（规范性）双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-EI JSA）B.1试剂B.1.1 包被抗体特异性的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.3底物对硝基苯磷酸二钠（pPP）。B.1.4 1 XPBST 缓冲液（pH7.4）氯化钠（NaCl）8.0 g、磷酸二氢钾（KHzPOQO.2 g、磷酸氢二钠（Na?

14、HP。，）1.15 g、氯化钾（KCD 0.2 g、吐温-20（Tween-20）0.5 ml,。溶于900 ml双蒸水中.并定容至1 000 ml.,4 储存。B.1.5样品抽提缓冲液（pH7.4）亚硫酸钠（az$O3）1.3 g、聚乙烯基哦咯烷酮（PVP.MW24 000-40 000）20.0 g。溶于900 ml.的 1 XPBST中.并用1XPBST定容至1 000 ml.,4 储存。B.1.6包被缓冲液（pH9.6）碳酸钠（Na2co3）1.59 g、碳酸氢钠（NaHC（）3）2.93 g。溶于900 mL双蒸水中用浓盐酸（HC1）调 pH至9.6.定容至1 000 mL,4 储存

15、。B.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）牛血清白蛋白（BSA）2.0 g、聚乙烯基哦咯烷酮（PVP,MW24 000-40 000）20.0 go溶于900 ml.1 XPBST中.并用1XPBST定容1 000 ml,4号储存。B.1.8底物缓冲液（pH9.8）二乙醇胺97 ml、氯化镁（MgClz）O.1 go溶于800 ml,双蒸水中.用浓盐酸（HC1）调pH至9.8.定 容至1 000 ml.,41储存。注：以上缓冲液也可以使用商品化试剂，稀释操作步骤按使用说明进行。B.2实验步骤B.2.1包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体每孔加100,u 甑联板加盖或用保鲜

16、膜 包好，37号孵育2 h。清空孔中溶液.用1XPBST加满各孔，2 min后倒掉孔中溶液.在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程.或使用洗板机按照上述步骤设定洗板程序.进行洗板操作。6SN/T 55282022B.2.2样品制备与加样待测样品按1：1O（W/V）加入抽提缓冲液.研磨成浆；2 000 g离心10 min.上清液即为制备好的 检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按照100以，孔加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照.并设置缓冲液孔做空白对照。联板加盖或用保鲜膜包好.37 孵育4 h或4 孵育过夜。附联板倒掉缓冲液.IX PBST洗涤4次.每次2 min。或者使

17、用洗板机按照上述步骤设定洗 板程序进行洗板操作。B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液将衡标抗体稀释至工作浓度.按照100例./孔加入到附联板中.酱联板加盖 或用保鲜膜包好,37 孵育4 h。筋联板倒掉缓冲液.再用1XPBST洗涤4次.每次2 min.或使用洗板 机按照上述步骤设定洗板程序.进行洗板操作。B.2.4加底物将底物P、PP加入到底物缓冲液中终浓度为1 mg/ml,（现配现用）.按照100凹1./孔加入到附联板 中.室温避光孵育。B.2.5读数在不同的时间内如30 min,60 min.90 min或更长时间.用衡标仪在405 nm处读取OD值，B.3 结果判定B.3.1质量控制

18、要求对照孔的。）由值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应在质量控制范围内.即：缓冲液和阴性对 照OO405值V0.15,阴性对照值0.05时.按0.05计算。阳性对照OD5值/阴性对照OD405值 5;同一样品的重复性基本一致。B.3.2 结果判定在满足B.3.1的质量控制要求后.结果原则上可以判断如下：样品。1）融/阴性对照。无5值2.判为阳性。样品。1）颌/阴性对照（）颌值在2左右.判为可疑样品.需重新进行检测.或用其他方法加以验证。样品。）融/阴性对照值2,判为阴性。若不满足B.3.1的质量控制要求.则不能进行结果判断。7S7T 55282022附录C(规范性)R I-PCR检测C.1试

19、剂C.1.1核酸提取试剂TRizol.裂解液或合格的RNA提取试剂盒、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇。C.1.2 RT-PCR 试剂M-MLV RT(200 U/ptL)、5 X RT 缓冲液、R、asin(40 U/MU JOXPCR buffer(含 Mg2+),dNTPs(10 mmol/L)、Taq 能(5 U/jzL)oC.1.3 电泳缓冲液(50 x 1AE)三羟甲基氨基甲烷(Tris)242 g.冰醋酸(CzHJ)2)52.1 ml.乙二胺四乙酸二钠(“zEDTA 2H2O)37.2 g.加水定容至1 L o用时加水稀释至1XTAE。C.2实验步骤C.2.1引物合成依据大麦条纹花叶

20、病毒3基因组保守序列.自行设计特异性扩增引物。正向引物 BSMV-Fl：5，-CGCGGAAATTCGTCAAGCAT-3，；反向引物 BSMV-R1：5-AGGAGTTGTTTCCGCCTGAG-3。产物大小为411 bp。C.2.2 总RNA提取称取0.1 g样品加液氮研磨成粉末状.迅速将其移入灭菌的1.5 ml,离心管中.加入1 mL Trizol 试剂剧烈震荡摇匀3 min；4 X：,12 000 g离心10 min；取上清液.加入0.2 mL氯仿.上下颠倒混匀.室 温静止3 min；4,12 000 g离心10 min；取上层水相.加等体积异丙醇.混匀；4,12 000 g离心 10

21、 min.弃上清；力口 75%冷乙醇洗涤沉淀；4,7 500 g离心2 min.弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后.溶于30 DEPC处理的超纯水中.一20 保存备用。注：此处以0.1 g样品为例进行核酸提取，实际检测时如样品量有变化，加入的试剂可按比例调整：或者按照商品化 RNA提取试剂盒进行操作。C.2.3 反转录反转录总体系为12.5在PCR管中加入3 4总RNA模板.1 下游引物BSMV-R1(20/zmol/L)，在65 温育7 min,然后，冰浴5 min,瞬时离心，再向PCR管中加入下列试剂:M-MLV RT(200 U/piL)0.5*L、5 X RT 缓冲液 2.5 piL、dN

22、TPs(10 mmol/L)0.5 piL,RNasin(40 U/pL)0.5 mLJ)EPC-H2()4.5 fzLo 混匀后，37 反应 60 min,95 反应 10 min。合成的 cDNA 于 4 冰箱 冷藏保存备用。C.2.4 PCR 扩增PCR 反应体系为 25 ptLo 在 0.2 mL PCR 管中加入 10X PCR buffer(含 Mg2+)2.5 dNTPs 8SN/T 55282022（10 mmol/Dl.O4八正向引物和反向引物（均为20凹mol/L）各1.0 ML,Taq酶（5 U/jzUO.2*L、cD-A模板3.0 M，、ddHz。16.3记“设置阳性对

23、照、阴性对照及空白对照.每个样品及对照设2个平行 处理。反应程序：95 5 min；95 1 min,58 30 sec,72 30 sec,35 个循环；72 10 min。注：如采用商业化一步法RT-PCR试剂盒，可参照说明书进行操作，将步骤C.2.3和C.2.4合并进行。C.2.5 琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶.按比例混匀上样缓冲液和PCR扩增产物.用DNA Marker作相对分子 质量标记进行电泳。电泳结束后.在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性D、A条带.并拍摄 记录。C.3结果判定阳性对照在411 bp左右处有条带.阴性对照和空白对照无特异性条带.待测样品出现与阳性对

24、照 一致的条带.可判定为阳性。阳性对照在411bp左右处有条带.阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带.可判定结果为 阴性。9S7T 55282022附录 D(规范性)大麦条纹花叶病毒实时荧光RI PCR检测1).1引物和探针合成依据大麦条纹花叶病毒,3基因组保守序列.自行设计特异性引物和探针。正向引物 BSMV-FQ：bCGCAATGCTTACCATCATCGG-31；反向引物 BSMV-RQ：5，-CATTCGCCCTGACAGTCTTCT-3，；探针 BSMV-PQ：5-FAM-GTTTCCGCCTGAGTCTCCGAGCACG-TAMRA-3。1).2 总R、A提取和反转录操作方法见

25、C.2.2和C.2.3。I).3 实时荧光PCR反应PCR 反应体系为 20,ULO 在 0.2 ml.PCR 管中加入 10X PCR buffer(含 Mg、)2.5 M，、dNTPs(10 mmol/L)1.0/1八正向引物BSMV-FQ和反向引物BSMV-RQ(均为10 fzmol/L)各0.44、探针 BSMV-PQ(10,umol/L)0.2/L、Taq 酶(5 U/rL)0.5 fzL、cDNA 模板 2.0 ML,ddH2O 13 凡。设置阳 性对照、阴性对照及空白对照.每个样品及对照设2个平行处理。反应参数：95 30 sec；95 5 sec,60 1 min.40个循环。

26、本反应参数适用于Quant Studio 5型荧光PCR仪.如使用其他荧光PCR仪，可根据仪器性能进行适当调整。操作方法按照仪器的使用 说明进行反应结束后保存各项数据和图像。1).4 结果判定如果阳性对照Ct值40.且无扩增 曲线：待测样品Ct40或无Ci值时.判定结果为阴性。待测样品Ct40.判 定结果为阴性；若重新测试的Ct值大于35且小于40.且扩增曲线明显时.则判定结果为阳性.10SN/T 55282022参 考 文 献1 Thomas W.Carroll Barley stripe mosaic virus：its economic importance and control,plant disease,1980,64(2)136-140.SN/T 5528-2022中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法 SN/T 52882022*中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部：(010)65194242-7530网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880X1230 1/16 印张1 字数28千字 2023年1月第一版2023年1月第一次印刷 印数1 500*书号：135173914 定价18.00元