QB∕T 5715-2022 发酵液中衣康酸的测定 高效液相色谱法.pdf

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1、ICS 67.180.20CCS X69QB中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5715-2022发酵液中衣康酸的测定 高效液相色谱法Determination of itaconic acid in fermentation liquorHigh performance liquidchromatography method2022-04-08 发布2022-10-01 实施中华人民共和国工业和信息化部发布QB/T 5715-2022_刖 s本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由中国轻工业联合会提出。本文件由全国食品工业

2、标准化技术委员会（SAC/TC64）归口。本文件起草单位：安徽省食品药品检验研究院、青岛琅珊台集团股份有限公司、中国生物发酵产业 协会、山东省食品发酵工业研究院、山东寿光巨能金玉米开发有限公司、武汉远大弘元股份有限公司、天津科技大学。本文件主要起草人：李建军、何俊、李悦明、冯志合、田延军、李静、徐建春、吴泽华、李霞、王晋、张居舟、张文文、程坚、张成林。本文件为首次发布。IQB/T 5715-2022发酵液中衣康酸的测定高效液相色谱法1范围本文件描述了发酵液中衣康酸的高效液相色谱测定方法。本文件适用于衣康酸发酵液中衣康酸的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不

3、可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。第一法高效液相色谱紫外检测器法4方法提要试样中的衣康酸经甲醇溶液提取或直接稀释，经强阴离子固相萃取柱净化，利用反相液相色谱柱分 离，用紫外检测器检测，外标法定量。5试剂和材料水为符合GB/T 6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1甲醇：色谱纯。5.1.2磷酸：优级纯。5.2试剂配制5.2.1甲醇溶液（1+1,体积比）：量取250mL甲醇（5.1.1）至500mL容量瓶，

4、用水定容，混匀。5.2.2 2%磷酸甲醇溶液：量取2mL磷酸（5.1.2）至100mL容量瓶，用甲醇（5.1.1）定容，混匀。5.2.3 0.1%磷酸溶液：准确吸取1mL磷酸（5.1.2）,转移入1 000 mL容量瓶，用水定容，混匀。1QB/T 5715-20225.2.4 0.1%磷酸甲醇溶液（87+13,体积比）：量取0.1%磷酸溶液（5.2.3）870 mL至1 000 mL容量 瓶，用甲醇（5.1.1）定容，混匀。5.3 标准品衣康酸标准品（CAS：97-65-4,C5H6。4）：纯度不小于99%,或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质。5.4 标准溶液配制提示：在衣康酸配制时注

5、意安全防护。5.4.1衣康酸标准储备液（2.0mg/mL）：精密称取20 mg（精确至0.1 mg）的衣康酸标准品（5.3）,用甲醇（5.1.1）溶解并定容至10 mL,此溶液衣康酸含量为2.0 mg/mL,于4 y下保存，有效期6个月。5.4.2衣康酸标准工作液：分别量取适量衣康酸标准储备液（5.4.1）,用0.1%磷酸甲醇溶液（5.2.4）配制成 5 mg/L、10mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 200 mg/L 的标准工作液，于 4 C保存，现配 现用。5.5 材料5.5.1强阴离子固相萃取小柱（SAX）：1000mg/6mL,或相当者，使用前依次用4mL甲醇

6、（5.1.1）、4 mL水、4 mL甲醇溶液（5.2.1）活化。5.5.2 0.45 pm滤膜，有机系。6仪器和设备6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。6.2 电子天平：感量0.1 mg和0.01 g。6.3 涡旋振荡器。6.4 氮吹仪。6.5 固相萃取装置。6.6离心机：转速不低于6 000 r/min。6.7其他实验室常用仪器。7分析步骤7.1试液制备量取500 mL发酵液搅匀，取适量体积经6 000 r/min离心5 min,称取上清液1.0 g（精确至0.01 g）于100mL容量瓶（可根据实际样品中衣康酸的含量，增加或减少称样量），用甲醇溶液（5.2.1）溶解 并定容。7.2净化移取

7、1.00 mL上述溶解液（7.1）转移至预先活化的SAX固相萃取柱（5.5.1）,控制流速约0.5 mL/min,弃去流出液，用1mL甲醇水溶液（5.2.1）淋洗，再用2%磷酸甲醇溶液（5.2.2）4mL洗脱，收集洗脱 液于氮吹管中，50 P下氮气缓缓吹至近千，用0.1%磷酸甲醇溶液（5.2.4）定容至1.0mL,涡旋30s溶2QB/T 5715-2022如果样品基质对衣康酸的;过滤后直接进行液相色谱将配制的标准卫作液,没有干扰,7.3标准曲线的制作解残留物，0.45 m滤膜（5.5.2）过滤，供高效液相色谱仪分析。曲线。援定容液经0.45即滤膜（5.5.2）坐标作图，绘制标;度由低到高的顺凝

8、液相焦谱仪测定，以峰面积为飘坐标，以浓度为横7.4仪器参考条件液相色谱参考条件如下a)b)c)d)e)f)色谱柱：C18(250|5 p,m)流动相：0.1%磷川麴，（5.2.4或具有的色谱柱;）;流速：0.8柱温：45检测波长:mL/min；3C；210 nml进样量：f p,Lo7.5测定将试样溶液注,在上述色谱条件下,7.6空白试验式中:Xmf1 000中衣康酸的浓度。,高效液相色谱仪中，测得相应的峰面积，由标准曲线得到试样m 标准溶液和试样溶液的高效液相色谱图见附录A图A.1。的步骤进行平行操作。(1)m x 1 000 x 1 000t平均值表示，保留3位有效数字。稀释倍数（杂改变称

9、样量，则为100）;换算系数。由标准曲线8分析结果的表述试样中衣康酸除不加试样外，采用完全(c-c0)xKxl 000（1）计算:样中衣康酸的单位为克每千克（g/kg）：标准曲瞬得试样溶衣康酸的浓度,空白试验中衣度，单位为毫试样 试样质容体积，单位为毫升（mL）；单位为克计算结果以重复性条件下获得的两次独立9灵敏度若取1.0 g样品测定，衣康酸的检出限为0.50 g/kg。3QB/T 5715-202210精密度12.4 标准溶液配制衣康酸标准储，同 5.4.112.4.2衣康酸标施|分别量取适准储备咨（12.4.1）,用0.1%磷酸甲醇下0.1 mg/mL,0.2 nwinL 0.5 mg/

10、mLk 1.0 mg/mL 2.0mg/mL 标准工(5.2.4)配制啦 0.05 mg/mL、保却现配现用。12.5 材料12.5.1强阴离j i 取小柱(SAX)：同5.5。12.5.2 0.45 Km滤磁，有成蛋、13仪器和设备高效液相色谱仪：配示差折光检测窗其他同6。4QB/T 5715-202214分析步骤14.1试液制备同 7.1 o14.2净化14.2.1 同 7.2。14.2.2如果样品基质对衣康酸的准确定性和定量没有干扰，可省略14.2,将定容液经0.45 滤膜（5.5.2）过滤后直接进行液相色谱分析。14.3 标准曲线的制作同 7.3。14.4 仪器参考条件液相色谱参考条件

11、如下：a）色谱柱：Cis（250 x4.6 mm,5 pn）或具有同等性能的色谱柱；b）流动相：0.1%磷酸甲醇溶液（5.2.4）；c）流速：0.8 mL/min；d）柱温：45；e）进样量：10（iL；f）示差折光检测器检测池温度：45 o14.5 测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中，测得相应的峰面积，由标准曲线得到试样溶液中衣康酸的浓度。在上述色谱条件下，标准溶液和试样溶液的高效液相色谱图见附录A图A.2。14.6空白试验同 7.6。15分析结果的表述试样中衣康酸的含量按公式（2）计算：（c-co）xrxlOOO.八 一 X/mxl 000(2)式中：X-试样中衣康酸的含量，单位为克每千克

12、（g/kg）；c 由标准曲线求得试样溶液中衣康酸的浓度，单位为毫克每升（mg/mL）；c0 由标准曲线求得空白试验中衣康酸的浓度，单位为毫克每升（mg/mL）；-试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）；/稀释倍数（若不改变称样量，则为100）;1 000换算系数。5QB/T 5715-2022计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。16灵敏度若取1.0 g样品测定，衣康酸的检出限为5.0g/kg。17精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。6QB/T 5715-2022附录A（资料性）衣康酸的色谱图衣康酸标准溶液色谱图见图A.1和图A.2图A.I衣康酸标准溶液色谱图（紫外检测器）图A.2衣康酸标准溶液色谱图（示差折光检测器）