SN∕T 5394-2022 苹果根结线虫检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS 6 5.020.20CCS B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 53942022苹果根结线虫检疫鉴定方法Detection and identification of Meloidogyne mali Itoh.Ohshima&Ichinohe.19692022-07-07 发布 2023-02-01 实施中华人民共和国海关总署 发布SN/T 53942022.t/.刖 百本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和

2、国海关总署提出并归口。本文件起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关技术中心、宁波中盛产 品检测有限公司。本文件主要起草人：顾建锋、方亦午、刘乐乐、陈先锋。ISN/T 53942022苹果根结线虫检疫鉴定方法1范围本文件规定了进出境植物检疫中苹果根结线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于进出境种苗、土壤、介质及植物产品等携带的苹果根结线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水

3、规格和试验方法GB/T 24829毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法SN/T 1157进出境植物苗木检疫规程SN/T 2117伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息学名：mali Itoh,Ohshima&Ichinohe,1969。英文名：Apple root-knot nematode。分类地位：线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),小杆目(Rhabditida),垫刃亚目(Tylenchi-na),垫刃总科(Tylenchoidea)，根结科(Meloidogynidae)，根结亚科(Meloidogyninae),

4、根结线虫属(Meloidogyne)0苹果根结线虫其他相关信息见附录A。5方法原理根结线虫二龄幼虫入侵寄主根部后固着寄生.逐渐发育为卵圆形或梨形雌虫.导致寄主根部膨大呈 根瘤状(见附录B)o因此.如现场检疫时在植物根部发现疑似根结.可直接剖检寻找雌虫.也可从寄主 植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫后,进一步用形态学或分子生物学方法.并参考 其寄主、地理分布等信息(见附录A),判断其种类。6器材和试剂6.1仪器设备和器具PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌 1S7T 53942022锅、微波炉、烘箱；漏斗、医用解剖刀、载玻片、

5、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调 式微量移液器（24.1 000例.）及相应的吸头。6.2 主要试剂除特别规定外所有实验用试剂均为分析纯实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、液氮、2XTaq MasterMix预混液、10XPCR缓冲液（Mg free）、蛋白酶 K（20 mg/mL）、限制性内切酶 Hinf I,ddH2O JOO bp Marker,GelRed 染料、50 X TAE 溶液、琼脂糖凝胶。7现场检疫与取样7.1症状检查现场检疫时应检查植株生长是否健康.选取生长不良、矮化、失绿、畸形等症状的植株挖取少量根 系.观

6、察根上是否有根结或根瘤状畸形。7.2取样按照SN/T 1157进行抽样和取样.对有根结等症状的重点取样。如无症状.则随机取样。对于进 境苗木.如数量不大于5株.要求对每株单独取1份样品.每份样品质量不小于500 g.取样深度为土表 下20 cm左右.要求多带些根如数量大于5株.则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中.标明品 名、报检号、来源国、检测要求等信息，及时送实验室检测。如小苗带土较少.则尽量多取根和土样.不带 土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法。8 实验室检验8.1线虫分离实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离.可将样品暂时保存于4 冷藏箱中。土壤、

7、介质、根系等样品应用改良漏斗法分离线虫（按照GB/T 24829）.根结可直接剖检分离线虫（按照 SN/T 2117）。8.2 体视显微镜镜检用改良漏斗法分离到的多数是根结线虫二龄幼虫偶尔有雄虫。样品中根结线虫常与其他多种线 虫混杂.须注意区分。根结线虫二龄幼虫较细小体长多在300/J（m500,um.行动迟缓.虫体一般内含 物较多.颜色偏深。雄虫体长达1 000 fzm1 500,um.行动迟缓。雌虫须剖开根结才能看到（但也有部 分根结线虫不引起明显的结节.或根结部分露出根表面）.呈球形或近梨形.长500即700,um.宽 300/im500 pim.乳白色或褐色。8.3 标本制作若镜检发现

8、二龄幼虫或雄虫需制作临时玻片或永久玻片（按照GB/T 24829）。若发现雌虫.应制 作会阴花纹永久玻片（按照SN/T 2117）。8.4 生物显微镜观察、拍照和测量仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微拍照.主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态.2SN/T 53942022雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态.背食道腺开口到口针基球的距离(dorsal gland orifice,DG。).二龄幼虫的体长、口针长度及基部球形态、尾形及透明区长度等特征。应在每张图片上加相应 标尺.测量并计算体长/虫体最宽处体宽(a)、体长/尾长(c)、尾长/肛门处体宽(c)等值。如样品足够.应测量雄虫、二

9、龄幼虫各20条以上。9形态学鉴定9.1二龄幼虫形态特征(见附录C)体长约430 km(362,um46 6 Hm).体纤细.环纹清晰。侧线4条。唇区略缢缩。口针纤细基部 球显著.中食道球卵圆形.瓣膜显著。尾圆锥形肛宽约8.4,um(5.9/m 1 0.9,um).尾长约33 Km(24凹m39 pirn)，尾末端多数近尖.偶尔钝圆或不规则.透明尾长3.9,um 12.7 pim.透明区附近体壁 常有缢缩(测计值见表1)。9.2 雌虫形态特征(参见附录D)虫体梨形或球形，颈部明显。肛门和阴门周围的表皮略高.导致会阴花纹和肛门、阴门不在焦平面 上。会阴花纹卵圆形或扁卵圆形线纹平滑细密。背弓和腹弓均

10、低平。有些横纹从侧面伸向阴门的两 端.尾端有环形线纹。侧尾腺口大有1个明显的纹线向后弯跨侧尾腺口。侧尾腺间距为21.4/m士 2.5 m(1 8.1 1um26.0*m)，略大于阴门裂宽 20.5 ptm+2.1 m(1 7.5 25.5 pim)，有时等宽。侧区有侧线1条2条。阴门与侧尾腺的直线距离为25.8 Mm+1.9,um(23.0/m28.6 m).阴门与肛 门的距离为 16.9 pim+1.5 jzm(15.1/m20.3,um)o9.3 雄虫形态特征(见附录D)热杀死后虫体后端略腹弯。侧线4条。侧尾腺在肛门略后。口针粗壮.前端尖细.基部球圆。DG。为6 Alm13,um。单精巢，

11、长约800,um。交合刺稍向腹弯.末端钝圆。引带短.新月形。9.4 与近似种的区别苹果根结线虫和杉并根结线虫M.suginamiensis Toida&Yaegashi.1 984最近似，两者雌虫会阴 花纹均为细环纹.二龄幼虫尾较短。但前者会阴花纹轮廓近卵圆形.环纹平滑.后者会阴花纹轮廓近方形.且环纹呈波浪状;前者尾略长,31/m(30/m34/m),尾末端一般锐尖.后者尾较短.25.2 m(20.8/m-27.3*m).且尾末端钝圆，苹果根结线虫会阴花纹与花生根结线虫M.a”a“a(、eal.l8 8 9)Chitwood,1949相似.但花生根 结线虫的阴门裂宽和侧尾腺间距平均值分别为32

12、“m和30,um.显著大于苹果根结线虫。且苹果根结 线虫的二龄幼虫平均尾长为31,um,显著短于花生根结线虫(58苹果根结线虫会阴花纹也与阿登根结线虫M.ardenenM Santos,1968相似.但后者阴门裂宽和侧 尾腺间距平均值分别为26,um和29.显著大于苹果根结线虫。苹果根结线虫与山茶根结线虫Golden,1979的区别是：前者雌虫会阴花纹为细环 纹,后者为粗环纹；前者的二龄幼虫体长平均约420 Atm.尾长32凹m.肛门处体宽8,um.后者分别为 500 m、47/Jim 和 10/im o9.5形态测计值二龄幼虫是检测过程中常见的虫态.而雌虫和雄虫的测量数据对种类鉴定的作用有限

13、因此表1仅 列出二龄幼虫的主要测计值。3S7T 53942022表1苹果根结线虫二龄幼虫测计值及与原始文献和近似种山茶根结线虫比较表单位为纳米（fxm）形态指标苹果根结线虫（顾建锋等，2013）苹果根结线虫（Itoh 等，1969）苹果根结线虫（Palmisano 等,2000）山茶根结线虫（王江岭等，2013）山茶根结线虫（Golden,1978）112025302570体长425+30.1(362466)418(390430)41320.6(373460)51226.4(462560)50121(443576)最大体宽14.0l.1(13.1 18.1)14.5(1416)14.21.8(

14、12.118.2)17.11.5(15.421.3)口针长10.5=0.5(9.511.6)14(12-15)10.00.8(8.511.1)11.60.5(10.712.3)11.60.2(11.2-12)DGO4.40.57(3.5 5.5)4.7(46)3.60.4(3.04.8)3.90.6(3.15.2)3.70.4(3-4.5)尾长32.73.0(29.239.3)31(3034)31.33.1(24.237.5)46.14.1(40.455.4)473.1(4036)肛门处体宽7.90.9(5.99.6)8.5(79)8.4=1.0(7.3 10.9)10.80.9(9.6 12

15、.7)透明尾长7.22.3(3.99.3)8.21.8(4.812.7)3.71.9(1.46.6)6.31.4(4-8.9)a30.42.6(25.234.5)28.5(273D29.53.4(22.335.5)30.12.9(22.633.8)261.8(2130)C13.21.1(11.6 15.3)13.3(12-15)13.31.2(11.516.6)11.11.0(9.212.7)10.70.6(9.5-12)C4.20.7(3.15.6)3.7(3-5)3.70.5(2.54.7)4.30.5(3.2 5.1)10分子生物学鉴定10.1特异PCR鉴定方法采用苹果根结线虫特异引物M

16、MF/MMR.进行特异PCR扩增.并同时采用通用引物D2A/D3B扩 增核糖体rRA的28 s基因片段.消除因引物等问题而导致未扩增出片段造成的假阴性。以苹果根结 线虫作为阳性对照，以其他线虫种类作为阴性对照.超纯水作空白对照。具体操作按照附录E执行。10.2 mtDNA-RFLP 方法mtDNA的COII/lr RNA基因片段扩增引物、程序参见Jianhua Xu等，以苹果根结线虫作为阳性 对照.超纯水作空白对照.PCR扩增产物采用限制性内切能Hinf I进行附切。具体操作按照附录F执行。10.3 D、A条形码方法采用引物D2A/D3B扩增28 SrRNA基因。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测

17、后.送到生物测序 4SN/T 53942022公司双向测序。获取的序列片段与、CBI中登录的苹果根结线虫和其他种类线虫的28 S rRNA基因序 列比对.通过序列相似性、系统发育分析等方法.确定是否为苹果根结线虫。具体操作步骤按照附录G执行。11结果判定已有多次截获经验的实验室可单独采用形态学或分子生物学方法进行鉴定。若为实验室首次截 获或在新的来源国或寄主上发现.应将形态学方法与分子生物学方法相结合进行判定。以二龄幼虫、雄虫或雌虫会阴花纹的形态特征或者特异PCR.mtDNA-RFLP和DA条形码等分 子生物学方法作为该线虫的鉴定依据.结合寄主、地理分布等信息，符合第9章或第10章的可鉴定为苹

18、 果根结线虫。12记录和标本样品保存若鉴定为苹果根结线虫应将剩余的线虫杀死、固定后制成永久玻片保存；可用4%甲醛固定后于 指形管中长期保存。应保存的记录信息包括样品编号、为害症状（包括相关照片）、被感染材料的状态和 来源、经鉴定的有害生物学名、测计数据、显微照片、标本鉴定人、鉴定时间、制作人、制作时间等信息。对含有线虫的剩余样品材料.经登记后妥善保存。保存期至少为6个月.期满后视情况作销毁 处理。5S7T 53942022附录 A(资料性)苹果根结线虫相关信息A.1发现历史苹果根结线虫mali Itoh.Ohshima&-Ichinohe.196 9最早在日本长野苹果根中发 现.196 9年由

19、Itoh等描述为新种。实际上.该种线虫在1959年就已经发现.但当时误判为花生根结线 虫因为两者会阴花纹形状近似。随后很长一段时间.大家认为该种线虫仅发生于日本。2000年，Palmisano和Ambrogioni将意大利榆树上发现的一种根结线虫命名为榆根结线虫M.疝.但当时仅 依据细微的形态差异.没有做同工甑和分子生物学研究。意大利的榆树是为防控榆树枯萎病(Dutch elm disease)而从荷兰引进的当时荷兰先后在Baarn和Wageningen建立了榆树枯萎病研究中心大量 从世界各国引进榆树进行研究。该研究中心的抗榆树枯萎病品种陆续推广到10个欧洲国家.分别是比 利时、英国、法国、爱

20、尔兰、意大利、西班牙、丹麦、德国、斯洛文尼亚和罗马尼亚等国.1992年推广到意 大利。2013年.荷兰的Ahmed等通过对日本的苹果根结线虫和意大利的榆根结线虫样品及模式标本进 行详细地比较和分析.明确榆根结线虫为苹果根结线虫的次异名。实际上.I96 0年在Baarn的榆树上 发现根结线虫就是苹果根结线虫.当时误判为花生根结线虫.就像同期日本也曾将它误判为花生根结 线虫。Ahmed等推测.因苹果根结线虫在日本能侵染榆树,而欧洲曾进口日本的榆树.因此苹果根结线虫 很可能从日本扩散到欧洲。2016年.美国北卡罗莱纳州的一种树篱植物卫矛上首次发现苹果根结线虫。该种线虫很可能也是 因为美国从国外引种抗

21、榆树枯萎病品种而引人的。A.2 寄主苹果)、揪子)、三叶海棠(sie/w/c/ii)、日本晚樱(Prunus)、月季(Rosa hybrida)、鲜红水杨梅(Ge，coccifieum)、葡萄 CVitis vinifera)、覆盆子(Rubus idaeus)、欧洲花楸(Sorhus auc u pa ri a)、山桑(Mor us)、无花果(Ficus ca rica)、柘(MadurafrMvsMdafa)、构树(Broussonetia 厂z厂a)、小构树(Broussonetia kaNivoki)、日本栗(Castavea creft at a)、欧洲水青冈(Fag us sylv

22、atica)、夏株(Querc 心)、春榆(us davidiana)、琅班榆(m us)、光榆(JJlmus glabra)、比利时榆(Ulm us hoi land ica)、鸡爪械(Ace 厂 palmatum)、桐叶械(A-cer pseudo platanus)、白三叶(TVi/olium re pens)、欧洲红豆杉(Tax us Oaccafa)、小花风仙花(/z pattens parvifbra)、番力口(Solanum Iycopersicum)、茄子(So/az tnelongena)、辣椒anmium)、黄瓜(Cucumis satiuus)、中国南瓜属(厂a spp.

23、)、西瓜(d“s znz/ga心)、大白菜(Brass&pe-ki nensis)、结球甘蓝(Brassica oleracea var.ca)、甘蓝型油菜(Brassica nap us var.olei f era)、牛蒂(A rlap pa)、稳公英(Tarcidaciini 胡萝 b(Daucus carotay y/ZS.Glycine 异株尊麻(IJrfMa dioic a)、欧洲鳞毛蕨(Dryopteris fl ix)、刺叶鳞毛蕨(Dryopteris earth usiana)、纤细老 鹳草(Geranium robertianum)oA.3 地理分布日本、意大利、荷兰、法国

24、、比利时、英国、美国。我国20世纪90年代曾报道福建漳州的柑橘及河南郑州的杨树上发现苹果根结线虫.但上述报道 6SN/T 53942022均未对发现的根结线虫种类进行详细、准确的描述和鉴定.至今尚无文献报道柑橘及杨树是苹果根结线 虫寄主.其鉴定是否准确还有待证实。因此.苹果根结线虫应为非中国种。A.4 危害苹果根结线虫能在寄主植物根部形成串珠状的巨大根结.影响寄主水分和营养成分的吸收.导致根 系受损.生长发育缓慢。在日本.该种线虫造成苹果产量损失可高达40%.它还是日本桑树最重要的病 原线虫.可造成桑树变矮、叶片减小.严重时导致桑树死亡。桑树盆栽接种试验表明.接种苹果根结线虫 后.1年内有30

25、%60%的桑树死亡。对2年3年生的桑树接种，对叶片产量的影响达10%20%。A.5传播途径自然状态下苹果根结线虫在土壤中扩散非常慢.但能通过土壤、介质和寄主植物携带进行远距离 传播也可通过机械设备、农具、鞋及农产品携带的土壤进行远距离传播。A.6潜在风险苹果根结线虫寄主非常广泛.对一些重要的经济作物（如苹果）和林业（如榆树）能造成危害。据日 本研究.苹果根结线虫是苹果的重要病原生物。此外.苹果根结线虫也可对蔬菜（十字花科、葫芦科、茄 科）和林业（水青冈属、林属）造成危害。苹果根结线虫一旦传入.防治或根除都非常困难.更换抗病品种 的成本很高.目前欧盟已将该种线虫列入A2类检疫性有害生物。因此.苹

26、果根结线虫的潜在分布、寄 主、危害都可能比已知的更广有必要予以高度关注。7S7T 53942022附录 B（资料性）苹果根结线虫危害症状图苹果根结线虫危害症状图见图B.1。说明：AB 寄主为苹果：CD 寄主为榆树：E-F寄主为香茄。图B.1苹果根结线虫危害症状图（引自Ahmed等.2013）8SN/T 53942022附录C（资料性）苹果根结线虫二龄幼虫形态特征图苹果根结线虫二龄幼虫形态特征图见图C.1。说明：A-幼虫整体；BE 幼虫头部；FM 幼虫尾部（标尺=10 um）4图c.1苹果根结线虫二龄幼虫形态特征图（引自顾建锋等.2013）9SN/T 53942022附录 D（资料性）苹果根结线

27、虫雄虫和雌虫会阴花纹形态特征图苹果根结线虫雄虫和雌虫会阴花纹形态特征图见图D.1。说明：AB雄虫头部：C-雄虫交合刺；D 雄虫侧线；EH 雌虫会阴花纹（标尺=10图I）.1苹果根结线虫雄虫及雌虫会阴花纹形态特征图（引自顾建锋等.2013）10SN/T 53942022附录 E（规范性）特异PCR鉴定方法E.1试剂1OXPCR 缓冲液（Mg-free）、蛋白酶 K、2X Tag MasterMix 预混液、ddHQE.2实验步骤E.2.1 DNA 提取将1条或数条线虫放入ddH2O几分钟后.挑取单条线虫放入200“PCR管中含8 ddH2（）和 14.10XPCR缓冲液（Mg free）,液氮中

28、放置1 min（或超低温冰箱放置20 min以上），85（加热 2 min.向PCR管中加入1 1 mg/ml.蛋白酶K.56 加热15 min.951加热10 min.得到DMA提 取液直接进行PCR扩增，E.2.2 特异PCR扩增E.2.2.1引物序列引物序列见表E.1。表E.1引物序列引物名称碱基序列扩增片段长度MMF5?-GGGACCGACGGCTT AGTG-3约 250 bpMMR5-CCGTTACACGACGAGAGTC-3E.2.2.2 特异PCR扩增反应体系及参数PCR 反应体系见表 E.2。反应参数 94 4 min；94 30 s,55 40 s,72 1 min,37

29、个循环;72 8 min。表E.2 PCR反应体系试剂名称加样量L2XTaq MasterMix 预混液25引物 MCF（浓度 10 gmol/L）2引物 MCR（浓度 10 Mmol/L）2DNA模板2ddH2O补足反应总体积至50 ML11S7T 53942022E.2.3 琼脂糖电泳E.2.3.1制备凝胶配制1.0%（质量浓度）的琼脂糖凝胶微波炉溶解后加入Gel Red染料（浓度为0.5 Mg/mL）o移液器吸取PCR产物5位.并选取100 bp DNA marker分别加到琼脂糖凝胶孔中。接通电源.以 3 V/cm5 V/cm电场强度电泳约0.5 h后观察结果。E.2.3.2 观察结果

30、电泳结束后.将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上拍照并保留结果。E.3 结果判断如阳性对照获得250 bp左右的扩增片段.阴性对照和空白对照无扩增片段.样品出现与阳性对照 一致的扩增片段可判断为阳性。如阳性对照、阴性对照和空白对照正确样品未出现与阳性对照一致的250 bp左右的扩增片段.判 定结果为阴性。如阳性对照、阴性对照和空白对照不正确,不管样品结果如何.应重复试验。12SN/T 53942022附录 F（规范性）mtDNA PCR-RFIJ,鉴定方法F.1试剂1OXPCR 缓冲液（Mg?-free）、蛋白酶 K、2XTaq MasterMix 预混液、Hinf I 酶、ddH?。F.2实验步骤

31、F.2.1 DNA 提取操作方法按照E.2.1执行。F.2.2 mtl）、A的COH基因片段扩增F.2.2.1引物序列引物序列见表F.lo表F.1引物序列引物名称碱基序列扩增片段长度C2F35?-GGTC AATGTTC AGAAATTTGTGG-3约 700 bpMRH1065?-AATTTCTAAAGACTTTTCTTAGT-3F.2.2.2 PCR扩增反应体系及参数PCR 反应体系见表 F.2。反应参数 94 2 min；94 10 s,48 30 s,6 8 1 min,35 个循环;72 10 mino表F.2 PCR反应体系试剂名称加样量L2XTaq MasterMix 预混液25

32、引物C2F32引物MRH1062DNA模板2ddH,O补足反应总体积至50 MLF.2.3 mtDNA PCR-RFLP 检测PCR RFLP反应体系见表F.3。反应参数37 1 h。13S7T 53942022表F.3 PCR-RFLP反应体系试剂名称加样量aLPCR扩增产物810XPCR 缓冲液（Mg-free）1Hinf I 酶0.5ddH,O补足反应总体积至10 pLF.2.4琼脂糖电泳操作方法按照E.2.3执行。点样时注意.PCR产物也要同RF1.P产物（薄切产物）一起跑胶拍照。F.3 结果判断PCR扩增产物片段大小为700 bp.附切后的片段大小为700 bp.即该PCR产物无Hi

33、nf I旃切位 点可判定为阳性。任何异于上述结果的均为阴性.或需要重复试验。14SN/T 53942022附录G（规范性）DNA条形码方法G.1试剂1OXPCR 缓冲液（Mg free）、蛋白酶 K、2X Tag MasterMix 预混液、ddHO。G.2实验步骤G.2.1 D、A 提取操作方法按照E.2.1执行。G.2.2 28 S rR、A基因片段扩增G.2.2.1引物序列引物序列见表G.1。表G.1引物序列引物名称碱基序列扩增片段长度D2A5ACAAGT ACCGTGAGGGAAAGTTG-3约 8 00 bpD3B5?-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3G.2.2.2 PC

34、R扩增反应体系及参数PCR 反应体系见表 F.2。反应参数 94 4 min；94 30 s,55 30 s,72 1 min,37 个循环；72 10 minoG.2.3琼脂糖电泳操作方法按照E.2.3执行。G.2.4 电泳结果该引物正常的PCR扩增产物片段大小为800 bp左右.若样品PCR扩增获得正常产物.可送扩增 产物到生物测序公司双向测序（可要求公司进行拼接），应每个样品做3个以上重复。G.3 DNA条形码分析G.3.1序列拼接使用Chormas软件或其他序列分析软件，对28 S rR、A基因测序得到的双向峰图文件进行拼接.去除引物区.获得相应的DA序列。为确保DNA条形码序列的可靠

35、性.需对测序质量进行评估.去除 测序结果两端的低质量序列，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。G.3.2 BLAST和系统发育分析登录 NCBI 网站中的 BLAST（basic local alignment search tool）页面（https:blast,ncbi.nlm.15S7T 53942022nih.gov/Blast.cgi）进行比对。在 Basic BLAST 中选择 nucleotide blast.在 Enter Query Sequence 中粘 贴需要鉴定的序列，点击左下角BLAST。查看待测线虫样品与其他已知序列的相似性.并可进一步在 网站中下载已登录的苹果

36、根结线虫及其他根结线虫近似种的部分序列.并使用MEGA或其他系统发 育分析软件构建Neighbor-Joining系统发育树。G.4 结果分析G.4.1 BLAST结果分析在BLAST结果中查看序列相似性最高（max ident）的物种.一般为与查询序列最接近的物种，若 BLAST比对结果显示.待测样品序列与已知的苹果根结线虫序列（GenBank中登录号为JX978 226.1、JX978 227.1.KX430177.1.KF8 8 0399.1,KF8 8 0398.1 等）相似性（Ident 值）达 95%以上，与其他种类的 相似性小于93%.可判定为苹果根结线虫。待测样品序列与已知的苹

37、果根结线虫相似性低于95%.则 可能不是苹果根结线虫。须注意.有时BLAST结果所显示的线虫不是根结线虫属线虫.甚至不是线虫.很可能是实验过程 中由于操作不当引入的其他微生物污染和样品交叉污染。须重复实验过程。G.4.2 系统发育树分析若系统发育树显示待测样品序列与已知所有苹果根结线虫均聚集在同一进化分支.可判定该线虫 样品为苹果根结线虫。若待测样品序列与已知苹果根结线虫分散在不同进化分支中.可判定为该线虫 样品不是苹果根结线虫。16SN/T 53942022参 考 文 献1 Itoh,Y.Oh shima Y.&Ichinohe 9 M.A root-knot nematode Meloid

38、ogyne mali n.sp.,on apple-tree from Japan(Tylenchida：I leteroderidae)J.Applied Entomology and Zoology.Tokyo,196 9,4：194-202.2 Toida.Y.I lost plants and morphology of the 2nd-stage larvae of Meloidogyne mali from mulberryj,Japanese Journal of Nematology 1979,9:20-24.3 Toida,Y.一种日本根结线虫对桑树的危害J.国外农学一蚕业.

39、1993,54：42-44.4张绍升，翁自明.福建省根结线虫的种类鉴定J福建农学院学报J991,20(2)：158-164.5李淑君.喻璋.河南省植物根结线虫并调查及其病原鉴定J.河南农业大学学报.1991,25(2):16 9-174.6 顾建锋.王江岭王金成.根结线虫非中国种问题初探J1植物检疫，2012,26(3):58-6 0.7顾建锋.王江岭.邵芳.等.日本鸡爪械中苹果根结线虫的鉴定J植物检疫，2013,27(1)：43-49.8 王江岭.张建成顾建锋.单条线虫DNA提取方法J.植物检疫20,25(2):32-35.9王江岭顾建锋.高菲菲等.日本苗木中山茶根结线虫的鉴定J.植物检疫，

40、2013(3):70-74.101 Marinari-Palmisano,A.&Ambrogioni,L.Meloidogyne ulmi sp.n.,a root-knot nematode from Nematologia Mediterranea 2000,28:279-293.11 Ahmed M.Vossenberg B.Cornelisse C.,et al.On the species status of the root-knot nematode Meloidogyne uhni Palmisano&.Ambrogioni,2000(Nematoda,Meloidogynid

41、ae)J.ZooK-eys,2013,36 2：l-27.1 2 Jianhua Xu.Peilei Liu.Qinpeng Meng,et al.Characterisation of Meloidogyne species from China using isozyme phenotypes and amplified mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphism European Journal of Plant Pathology2004,110：309-315.17SN/T 5394-2022中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 苹果根结线虫检疫鉴定方法 SN/T 53942022*中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)绢辑部：(010)65194242-7530中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 0X1230 1/16 印张1.5 字数40千字 2023年1月第一版2023年1月第一次印刷 印数1500*书号：155175707 定价24.00元