实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾.ppt

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1、生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n 了解凝胶层析的原理及应用了解凝胶层析的原理及应用n 通过血红蛋白脱盐实验，初步掌通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术握凝胶层析技术实验目的实验目的生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 凝胶过滤层析凝胶过滤层析：是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作是利用具有网状

2、结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的用，根据被分离物质的分子大小不同分子大小不同来进来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析行分离，也称分子筛层析、排阻层析实验原理实验原理生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”。不同类型。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。凝胶的筛孔的大小不同。交联葡聚糖的凝胶颗粒交联葡聚糖的凝胶颗粒生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验分子筛效应：分子筛效应：大分子在前，小分子在后大分子在前，小分子在后生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 高铁血红蛋白高铁血红蛋白分子量大分子量大(MetHb(MetH

3、b，红褐色，红褐色，Mw=64500)Mw=64500)，完全排阻完全排阻Hb K3Fe(CN)6MetHbu 高铁氰化钾高铁氰化钾分子量小分子量小(K(K3 3Fe(CN)Fe(CN)6 6，黄色，黄色，Mw=327.25)Mw=327.25)，可完全进入凝胶颗粒网孔内，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的从而达到分离的目的 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验交联葡聚糖交联葡聚糖高铁血红蛋高铁血红蛋白白与与高铁氰高铁氰化钾化钾混合物混合物高铁血红蛋白高铁血红蛋白高铁氰化钾高铁氰化钾生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 利用特制的半透膜把大小分子分开利用特制的

4、半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万的方法，截止分子量一般为一万临床应用：临床应用：血液透析血液透析 透析液透析液浓缩的蛋白浓缩的蛋白混合样品混合样品透析袋透析袋开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态 透透 析析 法：法：生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 钼酸铵钼酸铵 +氨基萘酚磺酸氨基萘酚磺酸 +磷酸盐磷酸盐钼蓝（蓝色）钼蓝（蓝色）15%三氯醋酸三氯醋酸+蛋白质蛋白质变性、沉淀变性、沉淀生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验器材与试剂实验器材与试剂 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器 血红蛋白溶液血

5、红蛋白溶液 交联葡聚糖交联葡聚糖G-25 0.4%K3Fe(CN)6 氨基萘酚磺酸试剂氨基萘酚磺酸试剂 钼酸铵试剂钼酸铵试剂 15%三氯醋酸三氯醋酸 0.1M磷酸缓冲液磷酸缓冲液生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验步骤实验步骤u 凝胶的处理凝胶的处理G-25G-25颗粒颗粒(5g)(5g)蒸馏水室温溶胀蒸馏水室温溶胀去除杂质去除杂质1010倍体积的蒸馏水浸泡倍体积的蒸馏水浸泡(过夜过夜)生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 装柱装柱固定在铁架上固定在铁架上加入缓冲液没过砂芯加入缓冲液没过砂芯将凝胶缓缓注入管内将凝胶缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达自然沉降至柱床高度

6、达20cm20cm以上以上 不可露出创面不可露出创面 盖滤纸盖滤纸层析管洗净、排出管中气泡层析管洗净、排出管中气泡关闭出口关闭出口关闭出口关闭出口打开出口打开出口生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验装柱要求装柱要求:连续连续 均匀均匀 无气泡无气泡 无分层无分层 床面平整床面平整生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 层析柱稳定后接储液瓶，打开出层析柱稳定后接储液瓶，打开出口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平衡平衡(5-10min)，不可露出床面，不可露出床面，关闭出口关闭出口u 平衡平衡生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 加样加

7、样准备血红蛋白准备血红蛋白(3(3滴滴)与与K K3 3Fe(CN)Fe(CN)6 6(8(8滴滴)混合液混合液自距床面自距床面1mm1mm高处靠壁缓慢、均匀加入高处靠壁缓慢、均匀加入至液面降至与凝胶面相平至液面降至与凝胶面相平放掉多余缓冲液至刚露出床面放掉多余缓冲液至刚露出床面打开出口打开出口生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u 洗脱与收集洗脱与收集至洗脱液刚好流入床面至洗脱液刚好流入床面再加洗脱液至再加洗脱液至3-4cm3-4cm高高连接储液瓶连接储液瓶 调节活塞（调节活塞（1 1滴滴/5/5秒）进行洗脱秒）进行洗脱缓慢加入样品量体积的洗脱液缓慢加入样品量体积的洗脱液（不冲破

8、胶面）（不冲破胶面）打开出口打开出口关闭出口关闭出口收集红褐色的收集红褐色的MetHbMetHb色带色带生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不能大分子不能进入珠内，进入珠内，经珠之间缝经珠之间缝隙流出隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中的凝胶吹至小烧杯中回收回收u 洗脱与收集洗脱与收集将黄色的将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，色带完全洗脱后，用用23倍柱床体积

9、的洗脱液冲洗凝胶倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验将将MetHb洗脱液装洗脱液装入透析袋入透析袋将透析袋将透析袋口用止水口用止水夹密封夹密封 打开磁力搅打开磁力搅拌器，透析拌器，透析30分钟分钟 将透析袋悬入将透析袋悬入装有蒸馏水的装有蒸馏水的烧杯中烧杯中u 透析透析生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 磷酸盐的鉴定磷酸盐的鉴定试剂量试剂量 钼酸铵试钼酸铵试剂剂氨基萘酚磺氨基萘酚磺酸试剂酸试剂反应结反应结果果透析前杯透析前杯内蒸馏水内蒸馏水1515滴滴2 2滴滴3 3滴滴？透析后杯透析后杯内蒸馏水内蒸馏水1010滴滴2 2滴滴3 3滴滴？u

10、鉴定鉴定生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定试液量试液量15%15%三氯醋酸三氯醋酸反应结果反应结果透析前杯内蒸透析前杯内蒸馏水馏水40滴滴20滴滴？透析后杯内蒸透析后杯内蒸馏水馏水40滴滴20滴滴？透析袋内溶液透析袋内溶液10滴滴5滴滴？生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验l 装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者重新装柱，保持柱床面平整；重新装柱，保持柱床面平整；l 洗脱时流速不可太快或太慢；洗脱时流速不可太快或太慢；l 透析袋中的液体不可装满，否

11、则会将透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。透析袋胀破。注意事项注意事项生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 磷酸盐的鉴定磷酸盐的鉴定试剂量试剂量钼酸铵试剂钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果反应结果透析前杯内透析前杯内蒸馏水蒸馏水15滴滴2滴滴3滴滴透析后杯内透析后杯内蒸馏水蒸馏水10滴滴2滴滴3滴滴无无蓝色蓝色实验结果实验结果生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定试液量试液量15%15%三氯醋酸三氯醋酸反应结果反应结果透析前杯内蒸馏水透析前杯内蒸馏水40滴滴20滴滴透析后杯内蒸馏水透析后杯内蒸馏水40滴滴20滴滴透析袋内溶

12、液透析袋内溶液10滴滴5滴滴无无无无有沉淀有沉淀生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 MetHbMetHb的相对分子量较大，直径大于的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔凝胶网孔被完全排阻在孔外，被完全排阻在孔外，只能在只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出短，移动速度快，首先流出生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度

13、慢，最后流出较长，移动速度慢，最后流出生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验l 磷酸盐磷酸盐是小分子，小于透析袋孔是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中留在袋中生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验u向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？面平整？上样体积为什么不能太大？u请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？或太慢？u圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？效应原理上有何不同？思考题思考题生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 实验项目实验项目 实验原理实验原理 试剂和器材试剂和器材 操作方法（主要步骤）操作方法（主要步骤）结果分析结果分析 思考题思考题生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验实验九实验九 酶法测血清葡萄糖酶法测血清葡萄糖预预 习习