实验酶联免疫吸附测定.ppt

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1、实验酶联免疫吸附测定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 抗原抗原-抗体反应的基本检测方法抗体反应的基本检测方法凝集反应凝集反应(agglutination):(agglutination):颗粒性抗原颗粒性抗原与抗体的反应。与抗体的反应。沉淀反应沉淀反应(precipitation):(precipitation):可溶性抗原可溶性抗原与抗体的反应。与抗体的反应。补体参与的反应补体参与的反应免疫标记技术免疫标记技术（immunolabelling t

2、echniqueimmunolabelling technique）:用用示踪示踪物质物质标记抗原或抗体，进行抗原标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。抗体反应的检测。基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室 用用示踪物质示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。或可测定的。免疫标记技术免疫标记技术基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室用用FITC-抗抗IgM单抗计数单抗计数B细胞细胞免免疫疫荧荧光光技技术术基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室

3、课程内容ELISA的原理的原理ELISA的分类间接间接ELISA的具体操作的具体操作ELISA在医学中的应用实例基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)(enzyme immunoassay,EIA)酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)原理：将抗原（抗体）原理：将抗原（抗体）固相化固相化，与酶标记的相应抗，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受

4、检物质酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。的量直接相关，由此进行定性或定量分析。方法：方法：直接直接ELISAELISA、间接间接ELISAELISA、夹心、夹心ELISAELISA、竞争、竞争ELISAELISA等等基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室ELISA的原理 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记E基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室ELISA的分类（一）直接法（一）直接法（二）间接法（二）间接法（三三）双抗体夹心法）双抗体夹心法（四四）竞争法竞争法 基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学

5、教研室室直接直接ELISA酶标一抗酶标一抗基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室 间接法的原理为间接法的原理为利用酶标记的抗抗利用酶标记的抗抗体以检测已与固相体以检测已与固相抗原结合的受检抗抗原结合的受检抗体，故称为间接法。体，故称为间接法。其优点在于只要其优点在于只要变换包被抗原就可变换包被抗原就可利用利用同一酶标抗抗同一酶标抗抗体体建立检测相应抗建立检测相应抗体的方法。可用于体的方法。可用于传染病的诊断。传染病的诊断。间接法（测抗体）间接法（测抗体）基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室夹心夹心（检测抗原）（检测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于只要获得针对受检抗

6、原的特异性抗体，就可用于包被固相载体包被固相载体和和制备制备酶结合物酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室竞争抑制法竞争抑制法 （检测抗原）（检测抗原）待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用

7、竞争法模式。小分子激素、药物等激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室washTMB标准标准HBcAg标准酶标HBcAbwash待检待检HBcAb 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室间接ELISA实验目的：实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗一抗：兔抗小鼠

8、IgG 酶标抗体/二抗二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/封封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀稀：pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液）洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）显色液：OPD（邻苯二胺）终止液/终终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠兔抗小鼠IgG(一抗一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室操作步操作步骤包被：包被：正常小鼠血清（正常小鼠血清（IgG）包被，）包被，100l/孔，孔，4过夜夜封封闭：弃去包被液，加入弃去包被液，加入5%5%脱脂奶粉

9、封脱脂奶粉封闭（2 200l/孔孔），），37,20min37,20min弃去封弃去封闭液，用洗液，用洗涤缓冲液（冲液（PBS/Tween20PBS/Tween20）洗板洗板3 3次次加入一抗：加入一抗：加入不同稀加入不同稀释度的兔抗鼠度的兔抗鼠IgGIgG血清（血清（100l/孔孔），以），以200200起始，空白起始，空白对照孔用洗液代替，照孔用洗液代替，37,20min37,20min洗板洗板3 3次次加入加入酶标二抗：二抗：加入加入HRP-HRP-驴抗兔抗体（抗兔抗体（100l/孔孔），），37,20min37,20min洗板洗板3 3次次显色：色：加入底物加入底物,100l/孔。室温

10、避光孔。室温避光显色色5-10min;2MH2SO4终止反止反应结果判定果判定 间接间接ELISAELISA基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室EE终止液终止显色终止液终止显色A,B两排同样操作，每孔加ul!包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4过夜加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37 15min加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37 15min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37 20min终止液终止液50ul 空白对照无显色加底物液显色底物液底物液100ul洗涤：3次，1min/次洗涤：3次，1min/次基基础础医学医学院免疫院免

11、疫学教研学教研室室A,B排上样完全相同：复孔AB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2-12号每孔号每孔00uL稀释液，稀释液，号孔加入号孔加入200uL一抗，从号孔吸取一抗，从号孔吸取100uL加到加到号孔中，混匀，从号孔吸取号孔中，混匀，从号孔吸取100uL加到号孔中，加到号孔中，混匀，号孔吸取混匀，号孔吸取uL，丢弃！，丢弃！每孔终体积每孔终体积100uL无无Ab,仅稀释液仅稀释液基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室病原微生物及其抗体检测如病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒肝炎病毒,SARS,SARS等等 临床疾病诊断中的应用临床疾病诊断中的应用蛋白质测定蛋白

12、质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标记物瘤标记物 非肽类激素测定：非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定，性激素测定 ELISA在医学中的应用基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室ELISA在其他相关领域中的应用科研服务科研服务食品安全食品安全 环境卫生环境卫生基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室DH2+H2O2 D+2H2O DH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。酶催化底物液显色E基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室酶/E底 物/DH2显色反应 测定波长nm 辣根过氧化物酶(HRP)邻苯二胺(OP

13、D)四甲替联苯胺(TMB)氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492450449425642碱性磷酸酯酶(AP)4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶(GOD)ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420-半乳糖苷酶(-Gal)甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色 360,450420 基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室结果的判定肉眼判定结果：肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应

14、为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“”、“”表示。各组各人独立观察记录。测定测定A值：值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室结果的判定空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅待检样品孔显色明显空白对照基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室定量方法：标准曲线待检样本待检样本基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室注意事项对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室需要搞清楚的问题1.什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。2.ELISA的原理、定义及基本分类3.实验对照的设立及其意义4.了解ELISA在临床中的广泛应用基基础础医学医学院免疫院免疫学教研学教研室室