实验八酶免疫技术精讲课讲稿.ppt

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1、实验八酶免疫技术精 酶标记免疫技术又称酶免疫技术：酶标记免疫技术又称酶免疫技术：抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性 酶促反应的专一性酶促反应的专一性基本原理：基本原理：Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物底物 显色显色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物底物 显色显色 该实验可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。该实验可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。相结合的技术相结合的技术敏感性高敏感性高特异性高特异性高不需特殊备不需特殊备酶免疫技术分类酶免疫技术分类酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相

2、酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定聚苯乙烯为固相载体聚苯乙烯为固相载体其他固相载体其他固相载体ELISA琼脂糖珠为固相载体琼脂糖珠为固相载体ELISA法检测乙肝标志物法检测乙肝标志物一、原理：一、原理：1.双抗体夹心法双抗体夹心法2.双抗原夹心法双抗原夹心法3.竞争法竞争法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原阳性阳性阴性阴性E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争法测抗原竞争法测抗原阳性阳性阴性阴性E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体

3、原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E二、试剂二、试剂有五种试剂盒，对应五种有五种试剂盒，对应五种HBV标志物标志物1、酶联反应板，聚苯乙烯固相载体，已包被妥已知抗原或、酶联反应板，聚苯乙烯固相载体，已包被妥已知抗原或抗体。抗体。2、酶标记物：、酶标记物：HRP标记的已知抗体或抗原。标记的已知抗体或抗原。

4、3、显色剂：分、显色剂：分A、B两种，分别是两种，分别是MTB和和H2O2。为。为HRP作作用的底物。用的底物。4、对照品：阳性对照血清、阴性对照血清、质控血清。、对照品：阳性对照血清、阴性对照血清、质控血清。5、其他试剂：如竞争法的标准抗原或抗体等。、其他试剂：如竞争法的标准抗原或抗体等。6、终止液：、终止液：0.2M的硫酸溶液。的硫酸溶液。7、洗涤剂：一般为、洗涤剂：一般为PB加非离子型表面活性剂。加非离子型表面活性剂。双抗体夹心法基本操作双抗体夹心法基本操作1、固相载体：聚苯乙烯塑料、固相载体：聚苯乙烯塑料2、包被：取已知抗体加入空白反应板中，置冰箱过夜，次、包被：取已知抗体加入空白反应

5、板中，置冰箱过夜，次日甩干，洗涤后备用。此为已包被好的反应板。日甩干，洗涤后备用。此为已包被好的反应板。3、加样：取待测样品、加样：取待测样品50L，加入反应孔内。，加入反应孔内。4、加酶标记物：取酶标记物、加酶标记物：取酶标记物50L，加入反应孔内。，加入反应孔内。5、水浴：、水浴：37度水箱度水箱30min。6、洗涤：每孔加满洗涤液，静置、洗涤：每孔加满洗涤液，静置15秒，甩出后拍干，连续秒，甩出后拍干，连续5次。次。7、显色：加显色剂、显色：加显色剂A、B液各一滴，水浴液各一滴，水浴15min显色。显色。8、结果观察，肉眼观察可不加终止液，直接观察，如用酶、结果观察，肉眼观察可不加终止液

6、，直接观察，如用酶标仪比色，需加终止液标仪比色，需加终止液50L于反应孔内，然后上酶标仪。于反应孔内，然后上酶标仪。9、注意事项：不同厂家其操作过程各不相同，注意看说明、注意事项：不同厂家其操作过程各不相同，注意看说明书。如用酶标仪，要设置空白、阳性、阴性，然后计算。书。如用酶标仪，要设置空白、阳性、阴性，然后计算。操作步骤操作步骤1、每两人一组，操作时认真看说明书。、每两人一组，操作时认真看说明书。2、每组分别测定两个组员的标本、阴性对照、阳性对照、空白对照。、每组分别测定两个组员的标本、阴性对照、阳性对照、空白对照。3、每组均要测定：、每组均要测定：HBsAg、抗、抗HBs、HBeAg、抗

7、、抗HBe和抗和抗HBc，共五，共五项项4、如图所示排列好反应孔、如图所示排列好反应孔HBsAg抗抗HBsHBeAg抗抗HBe抗抗HBc5、设定测定孔、阴性对照、阳性对照、空白对照。、设定测定孔、阴性对照、阳性对照、空白对照。6、加样品、酶标记物。血清竖排加、试剂横着加。、加样品、酶标记物。血清竖排加、试剂横着加。标本一标本二阴性对照阴性对照空白对照HBsAg抗抗HBsHBeAg抗抗HBe抗抗HBc7、水浴、水浴30分钟，甩干洗涤。每孔加满洗涤液，放分钟，甩干洗涤。每孔加满洗涤液，放置置15秒，甩干后拍干，反复秒，甩干后拍干，反复5次。次。8、加显色液、加显色液A、B每孔各一滴。水浴每孔各一滴

8、。水浴15分钟。分钟。9、观察结果。、观察结果。HBsAg、抗、抗HBs、HBeAg：阳性呈蓝色阳性呈蓝色 阴性无色阴性无色 抗抗HBe和抗和抗HBc：阳性无色：阳性无色 阴性呈蓝阴性呈蓝色色 大球形颗粒：亦称Dane颗粒小形球颗粒管形颗粒临床意义临床意义1HBsAgHBsAg：血清中检测到：血清中检测到HBsAgHBsAg，表示体内感染了，表示体内感染了HBVHBV，因而是一种特异性标，因而是一种特异性标志。志。HBsAgHBsAg阳性见于：阳性见于：急性乙型肝炎的潜伏期或急性期（大多短期阳性）急性乙型肝炎的潜伏期或急性期（大多短期阳性）；HBVHBV致的慢性肝病、迁延性和慢性活动性肝炎、肝

9、炎后肝硬化或原发致的慢性肝病、迁延性和慢性活动性肝炎、肝炎后肝硬化或原发性肝癌等。性肝癌等。无症状携带者。无症状携带者。2 2抗抗HBsHBs：表示曾感染过：表示曾感染过HBVHBV，不论临床上有无肝炎症状表现，均已得到恢，不论临床上有无肝炎症状表现，均已得到恢复，并且对复，并且对HBVHBV有一定的免疫力。有一定的免疫力。3 3HBcAgHBcAg与抗与抗HBcHBc：由于由于HBcAgHBcAg主要存在于肝细胞核内，并仅存在于主要存在于肝细胞核内，并仅存在于DaneDane颗粒颗粒中。因此，对病人血清不能检测中。因此，对病人血清不能检测HBcAgHBcAg，而测抗，而测抗HBc.HBc.血

10、清内抗血清内抗HBcHBc阳性反映：阳性反映：新近有过新近有过HBVHBV感染；感染；体内有体内有HBVHBV增殖；增殖；有助于诊断急性或慢性乙型肝有助于诊断急性或慢性乙型肝炎，特别是少数病例就诊时已处于急性恢复期早期，炎，特别是少数病例就诊时已处于急性恢复期早期，HBsAgHBsAg已从血中消失，已从血中消失，此时血中仅有抗此时血中仅有抗HBcHBc存在，因此，对恢复期患者可作病因追索。存在，因此，对恢复期患者可作病因追索。4 4HBeAgHBeAg和抗和抗HBeHBe：HBeAgHBeAg的存在常表示病人血液有感染性。的存在常表示病人血液有感染性。HBeAgHBeAg阳性揭示阳性揭示病人肝脏可能有慢性损害，对预后判断有一定帮助。抗病人肝脏可能有慢性损害，对预后判断有一定帮助。抗HBeHBe阳性对病人可阳性对病人可能有一定的保护力。能有一定的保护力。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢