实验六三过氧化氢酶活性的测定说课材料.ppt

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1、实验六三过氧化氢酶活性的测定蛋白质的颜色反应蛋白质相对分子质量的测定a.根据化学组成测定最低相对分子质量b.渗透压法测定相对分子质量c.沉降分析法（超速离心法）d.凝胶过滤法测定相对分子质量（分子筛层析）此法比较简单，不要求复杂的仪器，就能精确地测出Mre.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量根据分子大小不同的方法根据分子大小不同的方法透析和超过滤透析和超过滤利用溶解度差别的纯化方法（利用溶解度差别的纯化方法（实践最常用的方法实践最常用的方法a盐析盐析b有机溶有机溶剂分级分离剂分级分离）根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法 （PAGE、醋酸纤维素薄膜电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、离子

2、交换层析）离子交换层析）利用选择性吸附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法利用对配体的特异生物学亲和层析利用对配体的特异生物学亲和层析:一步处理即一步处理即 亲和力的纯亲和力的纯化方法可分离所需蛋白质，纯度很高化方法可分离所需蛋白质，纯度很高 蛋分离纯化白质的（一）蛋白质的含量测定一）蛋白质的含量测定凯氏定氮法凯氏定氮法双缩尿法双缩尿法 Folin-酚试剂法酚试剂法紫外吸收法紫外吸收法考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法 灵敏度高，重复好灵敏度高，重复好胶体金测定法胶体金测定法灵敏度最高灵敏度最高（二）蛋白质的纯度测定（二）蛋白质的纯度测定电泳、沉降、电泳、沉降、HPLCHPLC和溶解度分析等和溶解

3、度分析等。蛋白质的含量测定和纯度鉴定植物细胞DNA提取的方法CTAB法提取植物组织DNASDS法提取植物组织DNA以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法 植物RNA的 提取方法CTAB法、SDS法、快速SDS法、异硫氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等 电泳图称取样品，液氮研磨，加入预热的称取样品，液氮研磨，加入预热的(65)CTAB及及-巯基乙醇巯基乙醇 保温保温1h,期间不停的摇均期间不停的摇均吸取上清液吸取上清液,移至新的离心管中移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（加入等体积氯仿

4、：异戊醇（24：1），轻缓颠倒），轻缓颠倒混匀混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干乙醇清洗两次，吹干用用TE溶解溶解DNA,然后低温保存然后低温保存 过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶活性的测定 碘量碘量法法实实 验验 三三学时：学时：3 3生物体内重要的三种氧化酶类，其

5、作用均是生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是清除体内自由基：清除体内自由基：POD：过氧化物酶：过氧化物酶SOD：超氧化物歧化酶：超氧化物歧化酶CAT：过氧化氢酶：过氧化氢酶 1 1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；理和方法；2 2、了解过氧化氢酶的作用。、了解过氧化氢酶的作用。一、实验一、实验目的目的：植植物物在在逆逆境境下下或或衰衰老老时时，由由于于体体内内活活性性氧氧代代谢谢加加强强而而使使H H2 2O O2 2发生累积。发生累积。H H2 2O O2 2可进一步生成可进一步生成氢氧自由基（氢氧自由基（OHOH）。）。氢氢氧氧自自由由基基（

6、OHOH）是是化化学学性性质质最最活活泼泼的的活活性性氧氧，可可以以直直接接或或间间接接地地氧氧化化细细胞胞内内核核酸酸，蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子，并并且且有有非非常常高高的的速速度度常常数数，破破坏坏性性极极强强，可可使使细细胞胞膜膜遭遭受受损损害害，加加速速细胞的衰老和解体。细胞的衰老和解体。过过氧氧化化氢氢酶酶(catalase(catalase；CAT)CAT)可可以以清清除除H H2 2O O2 2、分分解解氢氢氧氧自自由由基基，保保护护机机体体细细胞胞稳稳定定的的内内环环境境及及细细胞胞的的正正常常生生活活，因因此此CATCAT是是植植物物体体内内重重要要的的酶酶促促防

7、防御御系系统统之之一一，其其活活性性高高低低与与植植物物的的抗抗逆逆性密切相关。性密切相关。二、实验原理二、实验原理:CAT活性大小以一定时间内分解的活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示：量来表示：在在一一定定条条件件下下，CAT能能把把H H2 2O O2 2分分解解为为H H2 2O O和和O O2 2。当当CATCAT与与H H2 2O O2 2反反应应一一定定时时间间(t)(t)后后，再再用用碘碘量量法法测测定定未未分分解解的的H H2 2O O2 2，以以钼钼酸酸铵铵作作催催化化剂剂，H H2 2O O2 2与与KIKI反反应应，释释放放出出游游离离碘碘，然然后后用用硫硫代硫酸

8、钠滴定碘，反应式为：代硫酸钠滴定碘，反应式为：H H2 2O O2 2（余）（余）+2KI+H+2KI+H2 2SOSO4 4-I-I2 2+K+K2 2SOSO4 4+2H+2H2 2O O I I2 2+2Na+2Na2 2S S2 2O O3 3-2NaI+Na-2NaI+Na2 2S S4 4O O6 6（连二硫酸钠）（连二硫酸钠）用用硫硫代代硫硫酸酸钠钠分分别别滴滴定定空空白白液液(可可求求出出总总的的H H2 2O O2 2量量)和和反反应应液液(可可求求出出未未分分解解的的H H2 2O O2 2量量)，再再根根据据二二者者滴滴定定值值之之差差求求出出分解的分解的H H2 2O

9、O2 2量。量。二、实验原理二、实验原理:1、实验材料：、实验材料：三叶草三叶草2、仪器：、仪器：(1)(1)滴定管滴定管 (2)(2)研钵研钵 (3)(3)容量瓶容量瓶 (4)(4)移液管移液管(5)(5)三角瓶三角瓶(100ml)(100ml)3 3、试剂：、试剂：（1 1）0.05M H0.05M H2 2O O2 2 （2 2）0.2M Na0.2M Na2 2S S2 2O O3 3 （3 3）1.8M H1.8M H2 2SOSO4 4 （4 4）1.5%1.5%淀粉溶液淀粉溶液 （5 5）10%10%（NHNH4 4)6 6MoMo7 7O O2424 （6 6）20%KI 20

10、%KI （7 7）石英砂）石英砂 三、实验三、实验材料材料、仪器和试剂：、仪器和试剂：1 1、酶液提取：、酶液提取：称称取取0.5g0.5g三三叶叶草草，加加少少量量石石英英砂砂，2ml2ml水水，研研成成匀匀浆浆，移移入入25ml25ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。2 2、酶促反应：、酶促反应：（1 1）取取锥锥形形瓶瓶2 2个个，编编号号A A，B B，各各加加入入10ml10ml酶酶液液，之之后后立立即即向向A A瓶瓶中加入中加入1.8mol/L H1.8mol/L H2 2SOSO4 45ml5ml，终止酶活性，作空白滴定。，终止酶活

11、性，作空白滴定。（2 2）向）向A A，B B两瓶各加两瓶各加H H2 2O O2 2 5ml5ml，摇匀，在加入，摇匀，在加入B B瓶那一刻起，记录瓶那一刻起，记录 时间，时间，5 5分钟后迅速向分钟后迅速向B B瓶中加入瓶中加入1.8mol/LH1.8mol/LH2 2SOSO4 45ml5ml，终止酶活性。，终止酶活性。3 3、滴定：、滴定：向向A A，B B两两瓶瓶各各加加1ml 1ml 20%20%KIKI和和3 3滴滴（NHNH4 4）6 6MoMo7 7O O2424，摇摇匀匀后后迅迅速速加加入入5 5滴滴1.5%1.5%淀淀粉粉溶溶液液，用用NaNa2 2S S2 2O O3

12、3进进行行滴滴定定至至蓝蓝色色恰恰好好消消失失，记录两次消耗记录两次消耗NaNa2 2S S2 2O O3 3的体积的体积V VA(A(空白空白)，V VB(B(反应液反应液)。四、实验步骤：四、实验步骤：称取0.5g的三叶草研磨过滤、定容至25ml容量瓶A瓶取酶液10ml,加入硫酸终止酶活性B瓶取酶液10ml,各加入5mlH2O2，B瓶5min后加入硫酸终止酶活性滴定反应酶活性测定酶活性测定管管号号酶酶液液(ml)1.8M 1.8M H H2 2SOSO4 4(ml)(ml)0.05M0.05MH H2 2O O2 2保保温温1.8M1.8MH H2 2SOSO4 4(ml)(ml)20%2

13、0%KIKI溶溶液液(ml)(ml)钼酸钼酸铵溶铵溶液液(滴滴)淀粉淀粉溶液溶液(滴滴)0.2M0.2MNaNa2 2S S2 2O O3 3溶液的溶液的滴定量滴定量A空空白白10555分分钟钟-135V VA(A(空白空白)=B反反应应10-55135V VB(B(反应反应液液)=1 1、被分解的、被分解的H H2 2O O2 2量（量（mgmg）=（空白滴定值（空白滴定值-样品滴定值）样品滴定值）Na2S2O3摩尔浓度摩尔浓度17172 2、CATCAT活性（活性（mg.gmg.g-1-1.min.min-1-1）=被分解的被分解的H H2 2O O2 2量（量（mgmg）(总体积总体积测定取液量测定取液量)样品重（样品重（g g）时间（时间（minmin）五、实验结果与计算：五、实验结果与计算：六、思考题：六、思考题：1 1、本本实验实验中影响中影响CATCAT活性活性测测定的因素有哪些？定的因素有哪些？2 2、测测定定过过氧化氧化氢氢酶酶活性的方法活性的方法还还有哪些？有哪些？3 3、测测定定植植物物过过氧氧化化氢氢酶酶活活性性的的生生物物学学意意义义是是什么？什么？此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢