实验三质粒DNA的酶切鉴定培训课件.ppt

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1、实验三 质粒DNA的酶切鉴定【实验器材实验器材】台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL,200 uL 1000uL）,1.5mL Enpendorf管。【实验材料实验材料】限制性内切酶（BamH I和Xho I）及酶切缓冲液、无菌水，质粒DNA溶液。【实验内容实验内容】1酶切有关基础知识介绍：2小量酶切，电泳鉴定。3.酶切体系的建立：成分成分单酶切单酶切双酶切双酶切质粒（质粒（T-AD）101010X缓冲液缓冲液22去离子水去离子水76BamH I 11Xho I-1总体积总体积 20ul20ul37度水浴1个小时酶切电泳图酶切电泳图M：DL5,000 DNA Marker；1：质

2、粒DNA；2单酶切质粒DNA（BamH I）；3：双酶切质粒DNA（BamH I和Xho I）。影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。酶切反应体系的组成：DNA量酶量（最多占总体积的1/10）总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，离心后保温酶切。I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在

3、DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1 000 bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。限制性内切酶分类限制性内切酶分类限制酶特点：限制酶特点：1.识别识别-8个相连的核苷酸，以个相连的核苷酸，以6个多见；个多见；限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列 Ba

4、mH I 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5Not I 5-GCGGCCGC-3 3-CGCCGGCG-52.呈回文结构呈回文结构(palindrome)；3.旋转对称性；旋转对称性；EcoRI 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。切点大多数在识别顺序之内，也有例外。Fok I 5-GGATGNN -3 3-CCTAC NN-5 外侧，产生外侧，产生3-端突起端突起5.识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。不能被切割。限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式

5、内切酶切割后产生的三种末端内切酶切割后产生的三种末端a)5 突出的粘性末端突出的粘性末端 如如,EcoR I 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5b)3 突出的粘性末端突出的粘性末端 如如,Pst I 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5c)平末端平末端 如如,Sma I 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5同裂酶同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。可以不同，来源不同的酶。（1）同裂酶（）同裂酶（Isoschizomers)完全同裂酶：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如识别位点和切点完全相同。如H

6、ind 和和Hsu I。Hind Hind 5-A 5-AAGCTT-3 AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA-5A-5Hsu I 5-AHsu I 5-AAGCTT-3 AGCTT-3 3-TTCGA 3-TTCGAA-5A-5同列裂酶和同尾酶同列裂酶和同尾酶XmaXma I 5-C I 5-CCCGGG CCGGG-3-3 3-GGGCC 3-GGGCCC C-5-5SmaSma I 5-CCC I 5-CCCGGGGGG-3-3 3-GGG 3-GGGCCCCCC-5-5识别位点相同，但切点不同。如识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶：不完全

7、同裂酶：AspAsp718I 5-G 718I 5-G GTACCGTACC-3-3 3-CCATG 3-CCATG GG-5-5KpnKpn I 5-GGTAC I 5-GGTAC C C-3-3 3-C 3-C CATGGCATGG-5-5同尾酶同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，但能切出相识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如同的粘性末端。如BamHI、Bgl、BclI、Xho等等（2）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers）5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTA

8、GA-5Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U U代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamBamHIHIBglBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamBamHIHIBglBglSau3A部分同裂酶的切割位点部分同裂酶的切割位点EnzymeEnzymeSequenceSequenceIsos

9、chizomersIsoschizomersAccAcc65I65IGGTACC GGTACC CCATGGCCATGGAspAsp718 I,718 I,KpnKpn I IAhaAhaIIIIIIT T TAAAT T TAAA AAATTTAAATTTDraDra I IBstBstMA IMA ICTGCAGCTGCAGGACGTCGACGTCPstPst I IEcoEcoRIRIGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGFun Fun II IINdeNdeI ICATATGCATATGGTATACGTATACFauFauND IND INheNheI IGCTAGCGCTA

10、GCCGATCGCGATCGAsuAsuNH I,NH I,BmtBmt I INotNotI IGCGGCCGCGCGGCCGCCGCCGGCGCGCCGGCGCciCciN IN ISmaSmaI ICCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCCCfrCfr9 I,9 I,PspPspA I,A I,XmaXma I,I,XmaXmaC I C I 部分同尾酶切割位点部分同尾酶切割位点EnzymeEnzymeSequenceSequenceIsoschizomersIsoschizomersBamBamHIHI5-G5-GGATCCGATCC-3-3 3-CCTAG3-CCTAGG G-

11、5-5BclBcl I,I,BglBgl II 5-A II 5-AGATCTGATCT-3-3 3-TCTAG3-TCTAGA A-55BclBcl I I5-T5-TGATCAGATCA-3-3 3-ACTAG3-ACTAGT T-5-5BamBamH I,H I,BglBgl II IIBglBgl II II5-A5-AGATCTGATCT-3 3 3-TCTAG3-TCTAGA A-5-5BclBcl I,I,BamBamH IH IPst Pst I I5-5-CTGCACTGCAG-G-3 3 3-3-G GACGTC-ACGTC-33Nsi Nsi I,5-I,5-ATGCAA

12、TGCAT-3 T-3 3-3-T TACGTA-3 ACGTA-3 NsiNsi I I5-5-ATGCAATGCAT-3 T-3 3-3-T TACGTA-5ACGTA-5Pst Pst I IDNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA加大酶的用量加大酶的用量延长保温时间延长保温时间 扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）一般采取一般采取大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2.D

13、NA的甲基化程度的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）；dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。突变的菌株。对不完全消化具有一定的影响对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构的分子结构 DNA的分子结构有三种的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构超螺旋结构、线性结构、单链开环结构是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供提供Mg2+和离子强

14、度；和离子强度；Tris-HCl：维持维持pH；二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求40-65 oC。酶酶酶酶最适温最适温最适温最适温度度度度o oC C酶酶酶酶最适温最适温最适温最适温度度度度o oC C酶酶酶酶最适温最适温最适温最适温度度度度o oC CApa IApa IBcl IBcl IMae

15、IIMae IITaq ITaq I3030505050506565Apy IApy IBstE IIBstE IIMae IIIMae III303060605555Ban IBan IMae IMae ISma ISma I5050454525255.酶切消化反应的时间和温度酶切消化反应的时间和温度 限制性内切酶储存在含限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有体积。否则对酶活性有抑制作用。抑制作用。6.反应体积和甘油浓度反应体积和甘油浓度质粒酶切鉴定质粒酶切鉴定通常设定反应体积为通常设定反应体积为

16、10-20l,质粒酶切大量酶切质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为通常设定反应体积为80-100l。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、一定的温度、离子强度、pHpH等条件下才等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。表现最佳切割能力和位点的专一性。7.星号（星号（*）活性）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（和切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（星号（*）活性）活性EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！大多数酶可用大多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。限制酶酶切反应的终止限制酶酶切反应的终止 此此课课件下件下载载可自行可自行编辑编辑修改，修改，仅仅供参考！供参考！感感谢谢您的支持，我您的支持，我们们努力做得更好！努力做得更好！谢谢谢谢