《 基因工程的基本操作程序》复习进程.ppt

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1、 基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的基因在另一种生

2、物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解5.5.基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较 概念概念：PCRPC

3、R全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA复制复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因)MgMg2+2+(激活剂激活剂)条件：条件：条件：条件：缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因

4、的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物前提：前提：前提：前提：过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环预变性（预变性（增加增加DNADNA变性的概率变性的概率）2 2、具体过程、具体过程PCR(多聚酶链式反应)概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_ _、_ _

5、、_._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂

6、，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶

7、细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链单链单链DNA DNA(cDNA(cDNA）双链双链双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成1）反转录法：）反转录法：以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使使使RNARNARNARNA为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互为模板，反转录成互补的单链补的单链补的单链补的单链DNADNADNADNA，然后在酶的，然后在酶的

8、，然后在酶的，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链作用下合成双链DNADNADNADNA，从而，从而，从而，从而获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。获得所需的基因。蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列结构基因结构基因的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的基因基因推测推测推测推测化学化学合成合成2）根据已知的氨基酸序列合成）根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞

9、中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终

10、获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶

11、：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基

12、因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，

13、并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点优点（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态

14、细胞吸收细胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 (关键步骤关键步骤).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA

15、分子杂交分子杂交（2）过程）过程:归纳步骤DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。P P1515思考与探究思考与探究（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测

16、目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA归纳步骤(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检

17、测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法

18、、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于

19、处。（填处。（填“a”或或“b”）aa练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定

20、耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交检测，又要用 方方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化和再分化脱分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运

21、载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD D练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基

22、因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在

23、基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并

24、能起始聚合酶结合并能起始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻片断，它能阻碍碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质

25、。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编

26、码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码