筛选赖氨酸.ppt

《筛选赖氨酸.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《筛选赖氨酸.ppt（19页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、筛选赖氨酸筛选赖氨酸实验目的：获得能高产赖氨酸的黄色短杆菌菌种实验目的：获得能高产赖氨酸的黄色短杆菌菌种实验原理：诱变产生苏氨酸营养缺陷型菌株，解实验原理：诱变产生苏氨酸营养缺陷型菌株，解除苏氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制。除苏氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制。3O-琥珀酸高丝氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸-半醛高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸赖氨酸赖氨酸高丝氨酸磷酸苏氨酸蛋氨酸异亮氨酸赖氨酸分支优先合成：蛋氨酸苏氨酸赖氨酸赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制出发菌株的选择 出发菌株：野生型黄色短杆菌 选择标准：对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高（该菌最适生长温度30-32）L-赖氨酸标准液：准确称取一定

2、纯品L-赖氨酸，溶解于一定量的蒸馏水中，水浴加热。配成不同浓度的标准液。培养基1.活化斜面培养基：葡萄糖2g/L、蛋白胨1g/L、牛肉膏1g/L、酵母膏5g/L、Nacl2.5g/L、琼脂20g/L、PH7.0-7.2，1Kg/cm3 灭菌15min。2.完全培养基：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、Nacl2.5g/L、琼脂20g/L、PH7.0-7.2、0.75Kg/cm3 灭菌20min。3.基本培养基：蔗糖30g/L、硫酸铵2g/L、醋酸铵3g/L、KH2PO43H2O3g/L、MnSO4H2O 0.01g/L、MgSO47H2O0.4g/L、FeSO

3、47H200.01g/L、琼脂粉20g/L、PH7.0-7.24.苏氨酸补充培养基：蔗糖30g/L，硫酸铵2g/L，醋酸铵3g/l，KH2PO43H2O1.5g/l、KH2PO43H2O3g/L、MnSO4H2O 0.01g/L、MgSO47H2O0.4g/L、FeSO47H200.01g/L、琼脂粉20g/l、苏氨酸0.1g/l,PH7.0-7.2,0.75Kg/cm3 20min悬菌液的制备菌体生长曲线的测定 取一环新鲜斜面活化菌种，转接于25ml的完全培养基的250ml三角瓶中，31、200r/min，振荡培养，前期每隔3小时取样，后期每隔1小时取样，稀释20倍用752G紫外分光光度计测

4、定吸光度。黄色短杆菌的对数生长曲线菌悬液的制备方法：同步化培养法 将黄色短杆菌于液体完全培养基中，通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，培养可获得同步细胞。然后在31、200r/min，振荡培养16h对菌液离心，用磷酸缓冲液洗涤2次。配制菌悬液:待菌液均匀悬浮后取4ml于装有16mlPH7.0磷酸缓冲液的250ml玻璃三角瓶中。前培养诱变处理前，可以在酵母膏的培养基中培养20-60min。前培养可以提高出发菌株对诱变剂的敏感性，从而使变异率大幅提高。诱 变采用化学诱变剂：硫酸二乙酯(DES)DES是一种诱变谱比较广泛的烷化剂，能与DNA中碱基的磷酸部分发生烷基化作用。一定剂量的DES对细菌具有致

5、死性。在较低的杀菌率下，正向突变率更高。一般采用杀菌率70%-80%甚至更低为宜。DES对黄色短杆菌的致死率曲线诱 变最终采用终浓度为1%的DES进行诱变处理。31恒温振荡30min。加入Na2S2O3溶液终止反应，摇匀。中间培养取1ml处理液置于25ml培养基250ml三角瓶中，31200r/min振荡培养过夜。变异菌株分离筛选 淘汰野生型：取10ml中间培养液，4000r/min 离心10分钟收集菌体，洗涤2次，将菌体转入MM中培养，31，振荡培养8-10h，加入浓度200u/L青霉素钠(现配现用），继续培养5-6h，使青霉素钠杀死野生型菌株，达到浓缩缺陷型的目的。检出缺陷型：将待测的浓缩

6、菌悬液涂布在CM上，等其长好后作为母平板（每平板上的菌落控制在50300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一MMMM平板上；经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平板上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。变异菌株分离筛选营养缺陷型的鉴定：采用滤纸片法。将待检菌株经斜面培养后制成菌液，用无菌水离心洗涤两次，取0.2ml菌液用涂布法制备含菌的基本培养基板；每皿放置若干无菌滤纸片，用20ul可调微量移液器依次往滤纸片上加上10ul特定无菌氨基酸或氨基酸混合液。31，培养48-72h.根据滤纸片周围长菌情况进行判定。变异菌株分离筛选筛选：取待检突变株斜面培养物一环接种到装有5ml种子培养基的大试管中，8层纱布封口，置于摇床上，31，200r/min，振荡培养2天。然后吸取0.5ml种子液接于装有5ml发酵培养基的大试管中，与上述相同条件下振荡培养96h。发酵液离心后取上清液作层析，以茚三酮溶液显色，以目测法选出L-赖氨酸位置紫色斑点较大且颜色较深者，视为L赖氨酸高产菌株。小 结 本实验以黄色短杆菌作为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）诱变处理，定向选育出能高产赖氨酸菌株，其遗传标记为苏氨酸缺陷菌株。结束结束