植物组织或器官中丙二醛含量的测定课件.ppt

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1、植物组织或器官中植物组织或器官中丙二醛含量的测定丙二醛含量的测定 制作人制作人：刘新刘新 单单 位位：生命科学学院生命科学学院 植物生理学教研室植物生理学教研室一、实验目的一、实验目的1.1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。方法。2.2.了解丙二醛积累对细胞的伤害了解丙二醛积累对细胞的伤害二、实验原理：二、实验原理：硫代巴比妥酸硫代巴比妥酸TBA丙二醛丙二醛3,5,5-三甲基恶唑三甲基恶唑2,4-二酮二酮 （三甲川）（三甲川）逆境逆境膜脂的过氧化作用膜脂的过氧化作用丙二醛丙二醛酸性酸性粉红色粉红色三、实验材料：三、实验材料：受干旱、高温、低温等逆境胁迫

2、的植物叶片或衰受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：实验仪器：实验仪器：紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 离心机离心机四、实验步骤：四、实验步骤：l1 MDA的提取的提取 称称2g叶片，加入叶片，加入5ml 磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（50mmol，pH值为值为7.8）及少量石英砂，）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力离心力作用下（作用下（4度）离心度）离心10min，其上清液即为，其上清液即为MDA提取液。提取液。l2 MDA的测定的测定 取取1ml MDA

3、提取液，加提取液，加3ml 27三氯乙酸和三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在。混和液在95度度水浴中保温水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，后，立即置于冰浴中冷却，然后离心然后离心10min，于波长，于波长532nm和和600nm下测下测定定OD值。值。五、结果计算五、结果计算l以测得的以测得的OD532OD532减去减去OD600OD600的非特异吸收值，按的非特异吸收值，按155mmol155mmol-1-1cmcm-1-1消消光系数计算光系数计算MDAMDA含量。含量。分别计算衰老和对照组的值。分别计算衰老和对照组的值。MDAMDA浓度浓度(molmol/L)=6.45(D

4、532-D600)-0.56D450/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA MDA含量含量(mol/gmol/g FW)FW)D450D450、D532D532、D600D600分分别别代代表表450nm450nm、532nm532nm和和600nm600nm波波长长下下的的光光密度值。密度值。六、注意事项：六、注意事项：1.0.1-0.5的三氯乙酸对的三氯乙酸对MDATBA反应较合适，若高于反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；2.MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴显色反应的加热时间，最好控制沸水浴1

5、0-15min之间。时间太短或太长均会引起之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸下的光吸收值下降；收值下降；3.如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。温离心机离心。4.低浓度的铁离子能增强低浓度的铁离子能增强MDA与与TBA的显色反应，当植物的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为（最终浓度为0.5 nmolL-1）5.可溶性糖与可溶性糖与TBA显色反应的产物在显色反应的产物在532 nm也有吸收（最也有吸收（最大吸收在大吸收在450 nm），当植物处于干旱、

6、高温、低温等逆），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。扰。思考题：思考题：1.通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？2.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。3.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？为什么要溶解在三氯乙酸中？4.为什么要测定反应液在为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？下的吸光度？5.丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？6.如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？办法消除其影响？7.正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。其原因。