微工第1章菌种与种子扩大培养.ppt

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1、微工第1章菌种与种子扩大培养 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望1 微生物工业用菌微生物工业用菌对菌种的要求对菌种的要求常用的工业微生物常用的工业微生物菌种保藏菌种保藏2 种子扩大培养种子扩大培养2.1 工业微生物的培养方法工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例种子扩培的实例2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种

2、子扩大培养#*q 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；q 从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；q 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#从自然界中分离菌种的一般过程采样采样 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系待改良性状的本质及与

3、发酵工艺的关系(2)对这一特定菌种的遗传生化的认识程度对这一特定菌种的遗传生化的认识程度(3)经济费用经济费用如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用则多半采用随机诱变、筛选及选育随机诱变、筛选及选育等技术；等技术；如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择则可选择基因重组基因重组等手段进行等手段进行定向育种定向育种。*抗生素生产有关的微生物放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与

4、种子扩大培养#氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌氨基酸生产有关的微生物2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#食品工业微生物 包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#1.能在廉价原料制成的培养基上

5、迅速生长和大量合成目的产物 -价值高2.能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。-可操作性强3.根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株4.菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生。5.菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳定性。-遗传稳定性强6.菌种非病原菌，不产生任何有害的物质和毒素，以保证产品的安全。-安全性强2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养

6、#目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生目的：保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能。产性能。基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的基本原理：根据菌种的生理生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼的状态。代谢活动处于不活泼的状态。基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的基本原则：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的环境。环境。休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境，休眠环境：微生物生长繁殖和代谢受抑，不易突变的环境，一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。一般要求低温、缺氧、缺营养、添加保护剂、干燥等。菌种保藏菌种保藏2

7、022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标及生化指标)。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#方法方法温度温度保护剂保护剂保藏时间保藏时间适用菌种适用菌种定期移植低温保藏法4低温无数月，短期各种微生物细胞液氮超低温保藏法-196-150甘油或DMSO长期适用范围最广，微生物、动物细胞甘油低温保

8、藏法-80-70（-18）甘油1年以上特别适用于基因工程菌沙土保藏法室温或低温数年芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌等麸皮保藏法20长期放线菌、霉菌等蒸馏水保藏法410较长时间酵母、真菌冷冻干燥保藏法干燥后，4左右低温避光处脱脂乳、蔗糖数年各种微生物细胞*最有效，适用范围最广，多数国家级菌种保藏单位常用*原则：慢冻快溶慢冻快溶*原理：利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*1.将10%甘油或DMSO作为保护剂分装与安培瓶（or冻干管）中2.将长有菌落的琼脂（or培养液）悬浮于已灭菌的保护剂中3.熔封安培瓶口（or

9、盖上冻干管的盖子）4.以1min下降1的速度降至-35，使瓶内悬浮液体冻结，然后将安培瓶置液氮罐（or液氮冰箱）中，于-130 以下储藏5.恢复培养时，从液氮中取出安培瓶（or冻干管），立即于3840 水浴中摇动，至瓶内冰全部融化，按常法进行培养。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#在超低温冷藏柜（在超低温冷藏柜（-70-80 ）中保藏菌种的一般方法是：中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞离心收

10、获对数生长中期至后期的微生物细胞2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜；4混混匀匀后后分分装装入入冷冷冻冻指指管管或或安安瓿瓿中中，于于-70-80超超低低温温冰冰箱中保藏。箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-21-2minmin。一些。一些细菌和真菌菌种可保藏细菌和真菌菌种可保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#超超低低温温冰冰箱箱2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌

11、种与种子扩大培养#冻冻干干保保藏藏：是是通通过过在在减减压压条条件件下下使使冻冻结结的的细细胞胞悬悬液液中中的的水水分分升升华华，使使培培养养物物干干燥燥。此此法法是是微微生生物物菌菌种长期保藏的非常有效的方法之一。种长期保藏的非常有效的方法之一。冷冻干燥步骤：*冻干样品的准备：准备菌种，与保护剂混合均匀，分装至安瓿管*预冻：2小时以上，温度达到-20到-35左右*冷冻干燥：8-20小时*真空封口及真空检验：安瓿管颈部用强火焰拉细熔封。氯化钴溶液检测真空度*低温避光保藏：4 2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养

12、菌种与种子扩大培养#菌种保藏机构菌种保藏机构国外国外：1.ATCC American Type Culture Collection.RockvilleMaryland.U.S.A美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。2.CSH（Cold Spring Harbor Laboratory），U.S.A冷泉港研究室，美国。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#3.IAM(Institute of Applied Microbiology),University of Tokyo,Japan日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。4.IFO(Institu

13、te for Fermentation),Osaka,Japan发酵研究所，日本大阪。5.KCC(Kaken Chemical Company Ltd,Tokyo,Japan科研化学有限公司，日本东京。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#6.NCTC(National Collection of Type Culture),London United Kingdom，国立标准菌种收藏所，英国伦敦。7.NIH(National Institutes of Health),Bethesda,Maryland,U.S.A国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。8.

14、NRRL(Northern Utilization Research and Development Division),U.S.Department of Agriculture,Peoria,U.S.A美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#中中国国，1970年7月，中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCMS），中国科学院负责，下设六个菌种保藏管理中心。l）CCGMC 普通微生物菌种保臧管理中心；北京、武汉2）ACCC 农业微生物菌种保藏管理中心；北京3）CICC 工业微生物菌种保藏管理中心；北京4）CMCC 医学

15、微生物菌种保藏管理中心；南京、北京5）CACC 抗生素菌种保藏管理中心；北京、成都、石家庄6）CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心；北京2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*衰衰退退的的表表现现：生生长长，代代谢谢（产产品品）*衰衰退退的的原原因因：保保藏藏不不妥妥 菌菌种种生生长长的的要要求求没没有有得得到到满满足足 （不不利利环环境境，回回复复突突变变等等）2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#菌种退化：菌种退化：传代传代菌种发酵力、繁殖力、产物得率菌种发酵力、繁殖力、产物得率2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培

16、养菌种与种子扩大培养#*防止衰退的方法：防止衰退的方法：1.分离复壮分离复壮2.合理改变培养条件合理改变培养条件3.减少传代次数减少传代次数4.诱变剂处理后重新分离单菌落诱变剂处理后重新分离单菌落*复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态的将保存在沙土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。*2

17、022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#菌种扩培的目的菌种扩培的目的q提供相当数量代谢旺盛的种子提供相当数量代谢旺盛的种子 -量、状态的需要量、状态的需要q得到纯、壮、多的培养物得到纯、壮、多的培养物 -菌种的驯化菌种的驯化-缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#菌种扩培的任务菌种扩培的任务实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长培养

18、基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长减少传代次数减少传代次数孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月个月生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。种子扩培的两个阶段种子扩培的两个阶段2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#三级发酵流程：三级发酵流程：斜面斜面 一级种子一级种子 二级种

19、子罐二级种子罐 三级种子罐三级种子罐 发酵罐发酵罐*静置培养法：嫌气发酵静置培养法：嫌气发酵通气培养法通气培养法固态培养法固态培养法液体培养法液体培养法2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#表面培养法表面培养法*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#回转式回转式往复式往复式*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*工工业业微微生生物物常常见见培培养养方方法法及及其其特特点点解释解释特点特点适用范围适用范围固态培固态培养养即曲法培

20、养，源于即曲法培养，源于传统制曲技术传统制曲技术酶活力高酶活力高可调温湿度可调温湿度酿造业酿造业液体深液体深层培养层培养液体培养，深层通液体培养，深层通风风可调节各种环境因素：可调节各种环境因素：营养物浓度，温湿度营养物浓度，温湿度等；无菌操作要求高等；无菌操作要求高几乎所有好几乎所有好气发酵：如气发酵：如有机酸、氨有机酸、氨基酸等基酸等载体培载体培养养可重复使用的多孔可重复使用的多孔材料，严格控制营材料，严格控制营养条件，结束后挤养条件，结束后挤压培养液抽提产物压培养液抽提产物兼具固体培养法与液兼具固体培养法与液体培养法的优点体培养法的优点可培养霉菌、可培养霉菌、酵母、放线酵母、放线菌等菌等

21、两步法两步法液体深液体深层培养层培养将营养生长期与生将营养生长期与生产期分开，分别控产期分开，分别控制不同条件制不同条件工艺可达到最优工艺可达到最优过程繁琐过程繁琐氨基酸生产氨基酸生产2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染无杂菌污染种子的质量控制：种子的质量控制：2022/11/12第一章

22、第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#*培培养养基基*种种龄龄与与接接种种量量*温温度度*pH值值*通通气气与与搅搅拌拌*泡泡沫沫*染染菌菌的的控控制制*种种子子罐罐级级数数影响因素影响因素种龄种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实验结果定。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养

23、菌种与种子扩大培养#接种量的确定接种量的确定 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#发酵级数的确定发酵级数的确定一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一般由菌

24、丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数一级种子罐开始计算发酵级数确定依据确定依据：发酵规模、菌体生长特性、接种量发酵规模、菌体生长特性、接种量级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级级谷氨酸的三级发酵：谷氨酸的三级发酵：一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子（小罐）（小罐）发酵发酵青霉素的三级发酵：青霉素的三级发酵：一级种子一级种子（小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2.3 种子扩大培养举例种子扩大培养举例例一

25、、谷氨酸生产的种子制备例一、谷氨酸生产的种子制备斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#1、斜面、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次2022/11/12

26、第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#2.一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#3.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐

27、中培养（容积为发酵罐的1%），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列pH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#二、青霉素生产的

28、种子制备二、青霉素生产的种子制备安瓿管安瓿管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#一、斜面孢子一、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左右左右2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#二、大米孢子二、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低

29、、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#3、一级种子、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨4、二级种子、二级种子培养基

30、：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，个期，1-4为年青期，为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#小节：常见工业微生物的种类和用途生产菌种的来源与保护控制种子质量的基本方法和手段思考题：在生产过程中如何控制种子质量？2022/11/12第一章第一章菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养#