抗血清的制备.ppt

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1、抗血清的制备 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验原理实验原理 在抗原刺激下可以使机体产生相应的抗体，在抗原刺激下可以使机体产生相应的抗体，由于抗体通常存在于血清中，因此也将机体受由于抗体通常存在于血清中，因此也将机体受到抗原刺激后的血清称为免疫血清，免疫血清到抗原刺激后的血清称为免疫血清，免疫血清中含有对应于该抗原的多个决定簇的多种抗体中含有对应于该抗原的多个决定簇的多种抗体即多克隆抗体。即多克隆抗体。实验原理实验原理 抗血清的制备分为三个步骤：抗

2、血清的制备分为三个步骤：抗原的制备与纯化抗原的制备与纯化 动物的免疫（注射途径、注射次数、间隔时间等）动物的免疫（注射途径、注射次数、间隔时间等）血清分离纯化与效价鉴定血清分离纯化与效价鉴定 试剂与器材试剂与器材 抗原与免疫对象抗原与免疫对象 细菌菌种（伤寒沙门菌细菌菌种（伤寒沙门菌O901）、）、健康家兔。健康家兔。试剂试剂 生理盐水、麦氏比浊管、石炭酸、防腐剂生理盐水、麦氏比浊管、石炭酸、防腐剂（0.02%叠氮钠或叠氮钠或0.01%硫柳汞）等硫柳汞）等 设备与器材设备与器材 剪刀、镊子、注射器、试管等器材和剪刀、镊子、注射器、试管等器材和冰箱、离心机等设备冰箱、离心机等设备实验方法实验方法

3、 伤寒杆菌伤寒杆菌O抗原的制备抗原的制备1.取经革兰染色做细菌纯度鉴定的伤寒沙门菌，密取经革兰染色做细菌纯度鉴定的伤寒沙门菌，密集划线接种于普通琼脂平板，集划线接种于普通琼脂平板，37培养培养2448小小时；时；2.用生理盐水将细菌菌苔洗于清洁、无菌的三角烧用生理盐水将细菌菌苔洗于清洁、无菌的三角烧瓶中，瓶中，置置60水浴或隔水煮沸水浴或隔水煮沸1小时小时使细菌的菌毛使细菌的菌毛破坏（破坏破坏（破坏H抗原）；抗原）；3.将菌液移入离心管将菌液移入离心管4000r/min离心离心10min，弃去，弃去上清，并用无菌生理盐水洗涤上清，并用无菌生理盐水洗涤2次；次；4.取少量处理过的菌液再次接种于琼

4、脂平板上进行取少量处理过的菌液再次接种于琼脂平板上进行无菌实验（无菌实验（37，24h），确定无活菌后用生理），确定无活菌后用生理盐水调整菌液浓度至盐水调整菌液浓度至109个个/ml，加石炭酸至终浓，加石炭酸至终浓度为度为0.5%，即为细菌，即为细菌O抗原抗原。实验方法实验方法 伤寒杆菌伤寒杆菌H抗原的制备抗原的制备1.取有鞭毛的伤寒杆菌密集划线接种于普通琼脂平板上，取有鞭毛的伤寒杆菌密集划线接种于普通琼脂平板上，37培养培养2448小时；小时；2.取出培养板，用含有取出培养板，用含有5%石炭酸（苯酚）的生理盐水洗下石炭酸（苯酚）的生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，移入无菌三角烧瓶中，置琼脂平板上

5、的菌苔，移入无菌三角烧瓶中，置37水浴水浴24h（或（或435天固定杀菌）；天固定杀菌）；3.做无菌试验，用生理盐水稀释成做无菌试验，用生理盐水稀释成10*9个个/ml，即为细菌，即为细菌H抗原。抗原。免疫日期（天）免疫日期（天）免疫途径免疫途径 抗原抗原 免疫剂量（免疫剂量（ml）1(9.8)多点皮内多点皮内 伤寒杆菌伤寒杆菌O或或H抗原抗原 1.0 6(9.13)静脉静脉 伤寒杆菌伤寒杆菌O或或H抗原抗原 0.5 11(9.18)静脉静脉 伤寒杆菌伤寒杆菌O或或H抗原抗原 0.5 16(9.23)静脉静脉 伤寒杆菌伤寒杆菌O或或H抗原抗原 1.0 19(9.26)静脉静脉 伤寒杆菌伤寒杆菌

6、O或或H抗原抗原 2.0 实验方法实验方法 免疫方案免疫方案实验方法实验方法 抗血清获取抗血清获取1.试血：末次免疫试血：末次免疫7d后试血，试血一般耳静脉或心脏采血，后试血，试血一般耳静脉或心脏采血，分离血清与伤寒沙门菌分离血清与伤寒沙门菌O或或H抗原做试验管凝集试验，凝抗原做试验管凝集试验，凝集效价（滴度）在集效价（滴度）在1：16003200之间时即可以放血，之间时即可以放血，若效价较低，可继续加强免疫；若效价较低，可继续加强免疫；2.放血：采用心脏采血以获得最大血量，置放血：采用心脏采血以获得最大血量，置37促进血块促进血块收缩，并用吸管吸取血清，收缩，并用吸管吸取血清，3000r/m

7、in离心离心10min去除残去除残余的红细胞。余的红细胞。实验方法实验方法 抗血清的鉴定抗血清的鉴定 效价的测定效价的测定 效价的测定可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试效价的测定可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单项免疫扩散、溶血试验、凝集反应、验、琼脂双向扩散、单项免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶免疫测定及放射免疫分析等方法进行测定。本实验以凝酶免疫测定及放射免疫分析等方法进行测定。本实验以凝集反应为例。集反应为例。特异性测定特异性测定 抗体的特异性通常以交叉反应率表示抗体的特异性通常以交叉反应率表示,交叉反应率交叉反应率可以用竞争抑制试验测定。可以用竞争抑制试

8、验测定。亲和力测定亲和力测定 亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分析法。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的度决定的。实验方法实验方法 抗体的保存抗体的保存 抗体的保存浓度为抗体的保存浓度为2030mg/ml为宜，加入为宜，加入1/10000的硫的硫柳汞或柳汞或1/1000的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，分装小瓶，置分装小瓶，置-20以下低温保存。以下低温保存。思考与讨论思考与讨论动物的选择动物的选择免疫方案的确定免疫方案的确定