DNA与RNA提取方法.doc

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1、实验三 Trizol法提取细菌总RNA 一、实验原理 Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5106)以及大量的组织(1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。 二、 主要试剂和器材 Trizol 溶液

2、 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水 超净工作台 2.0 mL离心管无Rnase 移液枪 紫外分光光度计 石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌 三、 实验步骤 一. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 1. 挑取大肠杆菌菌单菌落培养至稳定期取菌液 2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体 2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液盖紧管盖激烈振荡15 s室温静置5 min 412000 g离心 10 min取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中 3、 每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)盖紧盖剧烈振荡 15

3、s室温静置 3 min4, 12000 g, 离心10 min，小心吸取上层水相转入另一新的2.0mL 离心管，测量其体积,加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。 4、 加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡15 s，室温静置 3 min，412000 g离心 10 min小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管。 5、 加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)轻轻颠倒混匀，室温静置 10 min，412000 g离心 10 min，RNA 沉于管底，小心吸去上清 6、加1 mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒，洗涤沉淀47500 g离心 5 min,小心弃上清，微离

4、吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min。7、 各管用 30L DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60温育5 min，分装，-80贮存(可贮存5周)。 二. RNA 浓度的测定 取 10 L RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值。根据公式计算 RNA 的浓度。 RNA 浓度(g/L)= OD260 稀释倍数(200) 40(g/mL)/1000 纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.82.0若低于该值，表明存在蛋白质污

5、染，可重新用酚氯仿抽提。该值为 2.0 时RNA 纯度为最高。 三. RNA 质量检测 将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为如果 23 S和16 S 条带明亮、边缘清晰并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上则 RNA的质量较好。 (1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具水平放置在工作台上 (2) 准确称取 0.15 g琼脂糖加入 15 mL 1 TAE 中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 2 min),待冷却至60时,加入 EB(终浓度为 L/mL),充分混匀。 (3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶

6、倒入胶模中，凝胶厚度为 35 mm，置于室温下凝固。(4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液使液面高出凝胶 12 mm。(5) 用微量移液器将样品8L与上样缓冲液2L混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照2000bp。 (6) 盖上电泳槽盖调节电压 100 V电泳 15min 左右。(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果用凝胶成像系统照相保存。 四、注意事项 1. RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1% DEPC

7、浸泡过夜后高压蒸气灭菌)。用于RNA实验的试剂须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。 2、提取时操作带一次性手套、口罩等小心、细致、晃动及每次移液要轻在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个：一是小心RNAse的污染降解RNA二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。 3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先进行处理。 4. 一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳但是一般的琼脂糖电泳也可以需要上样量稍微大些并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解)跑完电泳立刻观察。 5、需要用EB染色

8、，Genefinder染色效果不好，其对双链DNA的效果好。 6、器材的处理尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用0.1% DEPC焦碳酸二乙酯水溶液在37下处理12小时。 （2） 然后在120下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。实验二 细菌DNA提取方案 一、实验原理要进行重组DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要。 作为基因工程的载体必须满足下面四个条件：1. 是一个复制子，有复制点

9、才能使与它结合的外源基因复制繁殖；2. 他必须要有很高的复制率，这样才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3. 有限制性内切酶的识别位点，便于外源基因的插入；4. 载体具有选择的遗传标识，以此判断载体是否进入受体细胞，并将其分离出来。因此 基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事。 对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁，提取难度将大于真核细胞。 细菌基因组DNA在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所

10、抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。（温和操作）。 另外制备的DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使DNA携带的盐离子。 对于细菌而言，有染色体DNA和质粒DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体DNA缠

11、绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体DNA。 大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是： （1） 溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜； （2） 解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质； （3） SDS 能与蛋白质结合成为R10SO3R2蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS 也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。

12、破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿异戊醇抽提除去。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收DNA。 此种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA 浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB 会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。 本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用乙醇将DNA沉淀下来。 二、实验材料LB液体培养液 酚/氯仿（1：1

13、）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，20密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68蒸馏水饱和，加入8羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。 核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）

14、溶于10mmol/LTrisCl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于20保存。 TEG缓冲液：pH8.0 25m mol/L Tris-HCl,10m mol/L EDTA,50m mol/L 葡萄糖,4mg/mL 溶菌酶 标准菌株：大肠埃希氏菌 碱裂解液：0.2mol/L NaOH,1%SDS 乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。 三、方法与步骤1) 将大肠杆菌接种于LB培养基在37C环境下，以150r/min震荡过夜培养。 2) 取1ml对数期菌液，12000rpm 5min； 3) 弃上清，将沉

15、淀溶于200ul丙酮，震荡混匀，冰浴5min。 4) 8000rpm离心2min，弃上清。 5) 将沉淀混于TEG缓冲液中，震荡混匀，冰浴5min 6) 加入200ulSDS裂解液，冰浴5min 7) 加入150ul乙酸钾溶液，冰浴15min，使其沉淀完全。 8) 4C下离心，12000rpm，5min。（乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS-Na+转化为溶解度很低的SDS-K+一起沉淀下来。）离心后，若上清液浑浊，应混匀后再冷至0C，重复离心，弃去上清。 9) 加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000rpm 2min（比单独用酚，氯仿除去蛋质效果更好。为充分除

16、去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀）。 10) 将上清移至新管，加入2倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。 11) -20C，15min后，4C下离心12000rpm 5min。 12) 1ml 70%冷乙醇洗涤沉淀，然后离心，弃去上清液。 13) 干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min 。14) 2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤(沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。) 15) 干燥，溶于50ul TE （倒数一二步是我们制备的DNA马上就要用的情况，若需保存，则是在使用之前加入RNase。） 革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性

17、菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。 四、实验注意 1. 提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤DNA。 2. 最好是风干。 3. 最好能够使用新鲜的菌体。过程中注意无菌操作。 4. 菌量有一定的要求，通常为菌液的OD600=1.9时，取1-2ml就可以了。 5. 第一步悬浮时，振荡的时间稍长一些（1-2分钟），充分悬浮菌体。 6. 裂解步骤中，如果不澄清说明菌体没有裂解，可能的原因有：a 菌量太大；b 该菌为厚壁的非革兰氏阴性菌。 7. 沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。 8. 加洗液Rnase A，量要加足，以防止清洗不净影响未来的实验。 9. 要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。 10. 加入乙酸钾后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止DNA被包埋在沉淀物内，不易释放出来。 11.注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相