第四节 微生物的培养与应用.doc

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1、 微生物的培养与应用主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏课题背景：19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识到保持培养物纯净的重要性。防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。在课题1中，我们将通过培养大肠杆菌（Excherichia coli）的实验，学习微生物培养的基本技术。学习目标：1、了解有关培养基的基础知

2、识；2、进行无菌技术的操作（重难点）；3、进行微生物的培养。一、基础知识（一）培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。1、培养基的类型和用途（1）按物理状态来分：类型配制特点主要应用固体培养基加入琼脂较多菌种分离，鉴定，计数半固体培养基加入琼脂较少观察运动、鉴定、菌种保存液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养液体培养基：（2）按功能来分：培养基类型配制特点主要应用鉴别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加（或缺少）某种化学成分菌种的分离例如：鉴别培养基：用含有伊红美蓝的培养基鉴别是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红

3、和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。选择培养基：用含有青霉素的培养基可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到真菌（酵母菌和霉菌）。（3）按成分来分培养基类型配制特点主要应用合成培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产2、培养基的营养成分不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质。另外还需要满足微生物生长的pH、特殊营养物质，例如：生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物，如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。碳源、氮源、生长因子的比较来源常用原料功能碳源CO2、NaH

4、CO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养型生物的主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成培养基组分提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨10g氮源和维生素NaCl 5g无机盐H2O定容在1000mL氢元素、氧元素3、培养基配制原则：（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例

5、。（3）pH要适宜：细菌pH为：6.57.5；放线菌pH为：7.58.5；真菌pH为：5.06.0。（二）无菌技术1、什么是无菌技术？无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法，包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。2. 消毒和灭菌有何不同？比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要

6、的技术。3、常用的消毒和灭菌方法有哪些？（1）消毒的方法：煮沸消毒法：100煮沸56min；巴氏消毒法：7075下煮30min或 80下煮15min；化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源；紫外线消毒：接种室、接种箱、超净工作台用紫外线照射30min。（2）灭菌的方法：灼烧灭菌例如：接种环、接种针、试管口等。干热灭菌：160170下加热12h。例如：玻璃器皿、金属用具等。高压蒸气灭菌：是最常用的灭菌方法，100kPa、121下维持1530min。例如：培养基、无菌水等。思考：1、无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：无菌技术还能

7、有效避免操作者自身被微生物感染。2、请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌；2、培养基的配制；3、培养基的灭菌；4、倒平板；5、微生物接种；6、恒温箱中培养；7、菌种的保存。三、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（用于培养细菌）牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g将上述物质溶解后，添加自来水，定容至1000mL操作步骤：1、计算、称量。2、

8、溶化。3、调pH：pH7.6。4、过滤：这一步可以省去。5、分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6、加塞。7、包扎。8、灭菌：将50mL培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。9、倒平板：待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。10、无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448

9、小时，以检查灭菌是否彻底。讨论：1、培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2、为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答

10、：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，还有穿刺接种和斜面接种等。1、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次画线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。讨论：（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗

11、？为什么？答：第一步灼烧接种环：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环：杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环：及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。（2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划

12、线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（4）平板划线时为什么不能划破培养基？答：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。2、稀释涂布平板法讨论：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，

13、说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。五、课题延伸菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法本课题知识小结：典

14、型例题例1、关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A是碳源的物质不可能同时是氮源B凡碳源都提供能量C除水以外的无机物只提供无机盐D无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还

15、是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）A防止杂菌污染B消灭杂菌C培养基和发酵设备都必须灭菌D灭菌必须在接种前解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。答案：B例3、下表是某微生物培养基成分，请

16、据此回答：编号成分含量粉状硫10g（NH4）2SO40.4gK2HPO44.0gMgSO49.25gFeSO40.5gCaCl20.5gH2O100mL（1）该培养基培养的微生物的同化作用类型是_。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入_，用于培养_。（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养_。（4）表中营养成分共有_类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是_。（6）右表中各成分重量确定的原则是_。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是_。解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培

17、养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是

18、固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂琼脂。答案：（1）自养型微生物（2）含碳有机物金黄色葡萄球菌（3）固氮微生物（4）3（5）调整pH（6）依微生物的生长需要确定（7）琼脂（或凝固剂）- 返回 - 同步测试一、选择题1、下列有关培养基的叙述正确的是（）A培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌2、不同培养基的具体配方不同，但一般都含（）A碳源、磷酸盐和维生素B氮源和维生素C水、碳源、氮源和无机盐D碳元素、氧元素、氢元素、氮元素3、获得纯净培养物

19、的关键是（）A将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵4、下列常用的无菌操作中错误的是（）A用酒精擦拭双手B用氯气消毒水源C实验操作应在酒精灯火焰附近进行D玻璃器皿（吸管、培养皿）可用酒精擦拭5、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是（）A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板6、有关倒平板的操作错误的是（）A将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上B使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌子上D等待平板冷却凝固后需要倒过来放置

20、7、有关平板划线操作正确的是（）A使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞C将沾有菌种的接种环迅速伸人平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放入培养箱中培养8、有关稀释涂布平板法，叙述错误的是（）A首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C再放在适宜条件下培养D结果都可在培养基表面形成单个的菌落9、涂布平板操作需要用到（）A接种环、滴管、酒精灯B接种环、移液管、酒精灯C涂布器、移液管、酒精灯D涂布器、接种环、酒精灯10、将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱的目的是

21、（）A对比观察培养基有没有被微生物利用B对比分析培养基是否被杂菌污染C没必要放人未接种的培养基D为了下次接种时再使用11、作为自养生物唯一碳源的是（）A糖类B石油C二氧化碳D花生粉饼12、大肠杆菌的代谢类型是（）A自养需氧B异氧严格厌氧C异养需氧D异养兼性厌氧13、菌种保藏应控制的条件是（）（1）湿度（2）低温（3）干燥（4）有光（5）隔绝空气（6）适当有氧A（1）（4）（6）B（2）（3）（6）C（1）（5）（6）D（2）（3）（5）14、下列物质中，不能用作酵母菌碳源的是（）A含碳有机物B蛋白胨C含碳无机物D花生粉饼等天然物质15、平板冷却凝后要将平板倒置，其意义是（）A利于大肠杆菌的接种

22、B防止杂菌污染C利于培养的冷却D防止皿盖冷却水倒流入培养基ACDDC CDDCB CDBCD二、非选择题16、19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。（1）根据你所掌握的知识分析导致生产失败的根源是什么？（2）由此得出研究和应用微生物的前提是防止_。显示答案16、（1）导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。（2）杂菌入侵，获得纯净的培养物。-END- 课外拓展目前世界上已知最大的微生物：1985年Fishelson、Montgomery及Myrberg三人发现一种生长于红海水域中的热带鱼（名叫surgeonfish）的小肠

23、管道中的微生物，这是当时世界上所发现最大的微生物。它外形酷似雪茄烟，长约200500m，最长可达600m，体积约为大肠杆菌的100万倍，这种微生物并不需由显微镜观察便可直接由肉眼察觉到它的存在。目前最大的微生物则是1997年，由。Heidi Schulz在纳米比亚海岸海洋沉淀土中所发现的呈球状的细菌，直径约100750m。这比之前所提的微生物大上100倍。目前世界上已知最小的微生物：支原体，过去也译成“霉形体”，它是一类介于细菌和病毒之间的单细胞微生物。地球上已知的能独立生活的最小微生物，大小约为100纳米。支原体一般都是寄生生物，其中最有名的当属肺炎支原体（M.Pneumonia），它能引起

24、哺乳动物特别是牛的呼吸器官发生严重病变。-END- 高考解析例1、下列关于微生物的培养与分离的说法正确的是（）A培养硝化细菌时CO2可作为碳源、氨可作为氮源B加入琼脂的鸡汤灭菌后可直接用于培养禽流感病毒C加入青霉素的培养基可以选择分离出细菌和放线菌D连续培养发酵罐的冷却水装置是为了降低酶的活性答案：A解析：硝化细菌是自养型生物，利用氧化氨获得能量，把CO2和水转化成有机物；病毒只能在活细胞内增殖，加入琼脂的鸡汤不含活细胞，不能培养禽流感病毒；青霉素对细菌和放线菌具有抑制作用，能够选择分离酵母菌和霉菌；发酵过程中，微生物发酵产热使发酵罐内温度上升，通入冷却水是为了降低发酵罐内的温度，从而保持酶的

25、活性。例2、下列是与微生物培养有关的问题，请回答：（1）某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是，碳源是，氮源是。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于培养基。按照化学成分分类，该培养基属于培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于。（2）将少量细菌接种到一定体积的液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定菌体数目，以时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，可得到细菌的曲线。该曲线中以菌体数目的对数作为纵坐标的原因是。实验室中，为了获得形态和生理特征一致的菌体，一般应在期取材；在生产中，常搜集

26、培养至期的细菌用于次级代谢产物的提取。解析：本题主要考查学生的理解能力，考查微生物的营养。第（1）小题，该培养基中，琼脂为凝固剂，葡萄糖为碳源，尿素为氮源；由于只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，可以用来选择出能够合成脲酶的细菌，在功能上称为选择培养基；由于其化学成分明确，故又称为合成培养基；由于该培养基中存在着有机碳源葡萄糖，故可推测从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于异养型。第（2）小题，在恒定容积的液体培养基上培养微生物，定期取样，然后以时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，所得的曲线称为微生物的群体生长曲线，之所以以菌体数目的对数作为纵坐标的原因是菌体数目往往非常大，且变化率也很高，直接以菌体数目为纵坐标不利于作图。实验室中，为了获得形态和生理特征一致的菌体，一般应在对数期取材；在生产中，常搜集培养至稳定期的细菌用于次级代谢产物的提取。答案：（1）琼脂；葡萄糖；尿素；选择；合成；异养型（2）群体生长；菌体数目往往非常大，且变化率也很高，以菌体数目的对数为纵坐标有利于作图；对数；稳定-END-