分子标记ppt课件.ppt

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1、分子标记ppt课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望1 概述概述 1.1 基本概念基本概念世间万物遗传多样性（遗传变异）世间万物遗传多样性（遗传变异）遗遗传传多多样样性性（遗遗传传变变异异）：遗遗传传信信息息的的总总和和，种种内内不不同同群群体体之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。之间或者一个群体内不同个体的遗传变异的总和。遗遗传传标标记记：是是指指可可追追踪踪染染色色体体、染染色色体体某某一一节节段段或或者者某某个个基基因因座座在在家家系系

2、中中传传递递的的任任何何一一种种遗遗传传特特性性。是是表表示示遗遗传传多多样样性性的的有有效效手手段段，可可以以明明确确反反映映遗遗传传多多态态性性的的生生物物特特征征。它它具具有有两两个个基基本本特征，即可遗传性和可识别性。特征，即可遗传性和可识别性。n 性状标记性状标记n（morphological marker）n 细胞学标记细胞学标记n（cytological marker）n 生化标记生化标记n（biochemical marker）n n 分子标记分子标记n(molecular marker)n形态标记形态标记（morphological marker）是指那些能够明确显示遗传多样

3、性的外部形是指那些能够明确显示遗传多样性的外部形态特征。态特征。特点：特点：1.简单直观、经济方便简单直观、经济方便 2.数量少数量少 3.易受环境影响易受环境影响 4.一些标记与不良性状连锁一些标记与不良性状连锁 5.周期长周期长n细胞学标记细胞学标记（cytological marker）细胞有丝分裂的中期和早后期染色体的核细胞有丝分裂的中期和早后期染色体的核型和染色体显带技术。型和染色体显带技术。特点：特点：1.不受环境影响不受环境影响 2.能进行一些重要基因的染色体区域定能进行一些重要基因的染色体区域定位位 3.材料来源难材料来源难 n生化标记生化标记（biochemical mark

4、er）主要包括同工酶、等位酶和贮藏蛋白标记，是指利用植物代谢过程中的具有特殊意义的生化成分或产物进行遗传多样性标记的技术。特点：1.表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；2.直接反映基因产物的差异，受环境影响小；3.有些生化大分子分离困难遗传标记遗传标记 （Genetic markerGenetic marker）性状标记性状标记（morphological markermorphological marker）细胞学标记细胞学标记（cytological markercytological marker）生化标记生化标记（biochemical markerbiochemical

5、marker）分子标记分子标记(molecular marker)(molecular marker)多态性少多态性少多态性少多态性少标记数量有限标记数量有限标记数量有限标记数量有限以以以以 基因表达结果（表现型）基因表达结果（表现型）基因表达结果（表现型）基因表达结果（表现型）为基础，是对基因的间接为基础，是对基因的间接为基础，是对基因的间接为基础，是对基因的间接反映反映反映反映 DNA分子分子标记标记有其独特的有其独特的优势优势:(1)直直接接以以DNA的的形形式式表表现现，在在生生物物体体的的各各个个组组织织、各各个个发发育育阶阶段段均均可可检检测测到到，不不受受季季节节、环环境境限限制

6、制，不不存存在在表表达达与与否否等等问题；问题；(2)自然界存在许多等位变异，无需人为创造，自然界存在许多等位变异，无需人为创造，多多态态性性高高；(3)遍布整个遍布整个基因基因组组，可检测的基因座位是无限的。，可检测的基因座位是无限的。以以以以DNADNA碱基序列变异为基础，是碱基序列变异为基础，是碱基序列变异为基础，是碱基序列变异为基础，是DNADNA水平遗传变异的直接反映水平遗传变异的直接反映水平遗传变异的直接反映水平遗传变异的直接反映分子标记分子标记 广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的广义的分子标记是指可遗传的、可检测的、与生物的表性性状连锁的DNA序列或蛋白

7、质。序列或蛋白质。狭义的分子标记只是指狭义的分子标记只是指DNA标记。标记。1.2 DNA分子标记的发展历史及类型分子标记的发展历史及类型 第一类分子标记：第一类分子标记：以以Southern杂交为基础的分子标记技杂交为基础的分子标记技术术 RFLP（1974）第二类分子标记：第二类分子标记：以以PCR为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术 SSR（1982）、）、RAPD（1990）、）、AP-PCR（1990）、）、AFLP（1993）、）、ISSR（1994）、）、SAGE（1995）第三类分子标记：第三类分子标记：以单核苷酸多态性为基础的分子标记技以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术

8、术 SNP（1998）、）、SRAP（2001）、）、TRAP（2003）基因组基因组DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA片段体外扩增片段体外扩增1.3 DNA分子标记产生的分子基础分子标记产生的分子基础PCR技术：polymerase chain reaction 限制性内切酶：restriction endonuclease 电泳：带电荷的物质在电场中的趋向运动。电泳：带电荷的物质在电场中的趋向运动。核核酸酸电电泳泳：核核酸酸分分子子由由于于带带负负电电荷荷，在在电电场场中中向向阳阳极极定定向向运运动动。根根据据核核酸酸电电泳泳的的介介质质可可以以分分为为琼琼脂脂糖糖凝

9、凝胶胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶（电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳。）电泳。同一种核酸分子由于大小、同一种核酸分子由于大小、电荷数相同，在电场电势和介电荷数相同，在电场电势和介质阻力固定的情况下，应当具质阻力固定的情况下，应当具有相同的迁移速率，而不同大有相同的迁移速率，而不同大小的核酸分子迁移率不同，从小的核酸分子迁移率不同，从而加以分离。而加以分离。三种情况：三种情况：1.DNA 序列酶切位点（或序列酶切位点（或PCR引物结合位点）引物结合位点）处的碱基发生突变，导致酶切位点（或者处的碱基发生突变，导致酶切位点（或者PCR引物结引物结合位点）消失、酶切产物（或者扩增产物）减少。合位点）消失、

10、酶切产物（或者扩增产物）减少。WMWM MW酶切产物电泳PCR扩增产物电泳2Kb3Kb3Kb2Kb 2.DNA 序列酶切位点（或序列酶切位点（或PCR引物结合位点）之间缺失（或插入）了引物结合位点）之间缺失（或插入）了一段核苷酸序列，或者是酶切位点（或者一段核苷酸序列，或者是酶切位点（或者PCR引物结合位点）之间的串引物结合位点）之间的串联重复单元数目发生了改变，导致酶切产物（或者扩增产物）片段长度联重复单元数目发生了改变，导致酶切产物（或者扩增产物）片段长度发生了改变。发生了改变。WWWWWWMMM1M2MMM1M24Kb1Kb5Kb5Kb4Kb5Kb4Kb1Kb5Kb4Kb4Kb5Kb3K

11、b5Kb4Kb3Kb3.单核苷酸突变，即DNA序列发生了单碱基转换（A与T或C与G）或颠换（A、T与C、G）ATCGAATGCGCATCGATTGCCCATCGAATGCACACCGAATGCGCWWMM2 常用分子标记方法常用分子标记方法2.1 限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)RFLP标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群标记是用限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的体的DNA，然后通过电泳和，然后通过电泳和Southern杂交技术在酶切后形成的杂交技术在酶切后形成的DNA片

12、段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的片段中发现这种不同。这种不同就是目的性状的RFLP标标记。记。特点：1.遍布，无限2.不受外界环境、发育阶段、器官等影响3.探针多4.DNA需求量大，纯度高5.技术要求高，成本大 RFLP的基本步骤：的基本步骤：1、DNA的提取的提取 碱法、碱法、CTAB、SDS 2、用限制性内切酶酶切、用限制性内切酶酶切DNAEcoR 5gDNA 10U 终体积终体积30-40l3、核酸电泳核酸电泳4.核酸杂交 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或是某一区段互核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列（或是某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对

13、原则形成稳定的双链分子的补）的两条多核苷酸链，通过碱基互补配对原则形成稳定的双链分子的过程。过程。若其中的一条链被认为标记上，该标记可以通过某种特定方法检若其中的一条链被认为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。探针是指经特殊化合物标记的、特定的、已知出，即成为所谓的探针。探针是指经特殊化合物标记的、特定的、已知的核苷酸序列。的核苷酸序列。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，我们以特定的已知核苷酸序列为探针同样标记，可被检测出来。这样，我们以特定的已知核苷酸序列为探针就可以在诸多的核苷

14、酸序列中找到所需核苷酸。核酸杂交包括就可以在诸多的核苷酸序列中找到所需核苷酸。核酸杂交包括Southern杂交、杂交、Northern杂交。杂交。蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理来进行检测的，蛋白质分子杂交是利用抗原与抗体特异结合的原理来进行检测的，称为称为Western杂交。杂交。探针的标记：同位素标记、生物素标记（地高辛标记，Digoxigenin）支持物支持物重重 物物转移缓冲液转移缓冲液Whatman 3MM 滤纸滤纸杂交膜杂交膜吸水纸吸水纸注意事项：1.DNA要完整，纯度要高2.气泡3.多种酶2.2 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA(random amplified p

15、olymorphic DNA，RAPD)建立于建立于PCR 技术基础之上的一种技术。它分别以具有相技术基础之上的一种技术。它分别以具有相对性状的基因组对性状的基因组DNA为模板，以一个为模板，以一个10bp随机寡核苷酸作引随机寡核苷酸作引物进行物进行PCR扩增反应，在扩增产物中查找与目的性状相连锁的扩增反应，在扩增产物中查找与目的性状相连锁的DNA片段（即差异片段），获得的片段就是目的性状的片段（即差异片段），获得的片段就是目的性状的RAPD标记。标记。特点：1.试验步骤少；2.没有物种特异性；3.技术简便；4.DNA样品量少；5.易发现多态性；6.显现标记7.重复性不高；8.存在共迁移问题基

16、本步骤：基本步骤：1、DNA的提取；的提取；2、用随机引物对两个相对性状个体进行、用随机引物对两个相对性状个体进行PCR扩增；扩增；（1）模板（）模板（2）引物）引物（3）缓冲液（）缓冲液（4）Mg2+（5）dNTP（6）耐热）耐热DNA聚合酶聚合酶 变性、退火、延伸变性、退火、延伸 3、用凝胶电泳分开产物、用凝胶电泳分开产物DNA片段；片段；4、查找特异的与目的性状共分离的、查找特异的与目的性状共分离的DNA片段；片段；注意事项：1.冰上加样操作；2.DNA质量；3.反应灵敏，防止污染；4.影响因子多，要调体系；5.琼脂糖凝胶-聚丙烯酰胺凝胶；6.转变为别的标记DNA指纹技术指纹技术(DNA

17、 fingerprinting，DNF)原理与原理与RAPD技术相同，技术相同，不同的是，在不同的是，在DNF分析中，分析中，引物浓度更高，引物长度更短，引物浓度更高，引物长度更短，一般一般6个碱基，产物片段比较小个碱基，产物片段比较小且极为丰富，往往用聚丙烯酰且极为丰富，往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，胺凝胶电泳，DNF通常会产生通常会产生非常复杂的带型非常复杂的带型。任意引物PCR(Arbitary primer PCR，AP-PCR)武断的选择一个非特异性引物，在标准的PCR体系中，首先在不严格的条件下使引物与待分析的DNA序列通过错配而复性，如果两个引物之间的序列符合扩增的条件则可以进行扩增

18、，再后期严格的扩增条件下产生指纹图。引物的选择：M13-20测序引物影响因素：盐浓度、复性温度、模板浓度、引物浓度操作步骤：1.DNA的提取2.PCR反应：先宽松后严格3.电泳观察分析2.3 序列特征扩增区域序列特征扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)先做先做RAPD或或DNF分析，然后把标记片段测序，根据片段分析，然后把标记片段测序，根据片段两端的序列设计一对特定引物（通常两端的序列设计一对特定引物（通常16-24个碱基），再对具个碱基），再对具有相对性状的两个基因组进行有相对性状的两个基因组进行PCR特异扩增，这样就可把与特异

19、扩增，这样就可把与相对性状对应的序列单一扩增出来。这样的相对性状对应的序列单一扩增出来。这样的DNA片段与原先片段与原先的性状存在对应关系，就称为该性状的的性状存在对应关系，就称为该性状的SCAR标记。标记。Random primerRandom primerspecific primer 1specific primer 2RAPD markerSCAR markerSequencing SCAR比比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（原因是使用的引物长）。因是使

20、用的引物长）。SCAR的操作过程：的操作过程：RAPD标记技术分析；标记技术分析；回收特异回收特异RAPD扩增片段；扩增片段；RAPD产物克隆与测序；产物克隆与测序；RAPD产物特异引物设计；产物特异引物设计；特异引物引导下的特异引物引导下的PCR反应；反应；电泳获得电泳获得SCAR标记。标记。2.4 简单序列重复标记简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）真核生物基因组含有分散重复序列和串连重复序列两种类型的重复真核生物基因组含有分散重复序列和串连重复序列两种类型的重复序列。根据重复序列的长度、拷贝数和位置等又将串连重复序列分为卫序列。根据重复序列的长度、拷贝

21、数和位置等又将串连重复序列分为卫星星DNA（基序长（基序长100300bp）、小卫星）、小卫星DNA（基序长（基序长1060bp）、）、微微卫星卫星DNA（基序长（基序长16bp，如如 CA、CTCG）等几种类型。）等几种类型。SSR根据简单重复序列外两翼的特定短序列设计引根据简单重复序列外两翼的特定短序列设计引物，用来扩增重复序列本身，由于重复的长度变化物，用来扩增重复序列本身，由于重复的长度变化极大，所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来极大，所以会得到不同长度的片段。如果扩增出来的某个片段与某个特定性状存在对应关系，则该片的某个片段与某个特定性状存在对应关系，则该片段为该性状的段为该性状

22、的SSR标记。标记。SSR原理原理 重复单元：重复单元：1 6bp,如如 CA,CTCG 重复次数：重复次数：5 30 次次 覆盖长度：覆盖长度：10300 bpn特点：1.数量多且平均分布；2.位于内含子中；3.共显现遗传；4.结果重复性高；5.引物问题SSR 多态性多态性2.5 简单重复序列间区标记简单重复序列间区标记（inter-simple sequence repeat,ISSR）进行进行SSR反应需要知道两侧序列以设计引物，但大多反应需要知道两侧序列以设计引物，但大多数情况下这些序列并不知道。为了解决这一问题，提出数情况下这些序列并不知道。为了解决这一问题，提出了了ISSR标记。标

23、记。设计出各种能与设计出各种能与SSR序列结合的序列结合的PCR引物，这些引物引物，这些引物的的3端或端或5端加上端加上24个随机核苷酸，通过个随机核苷酸，通过PCR反应，对反应，对两个相距较近，方向相反的重复序列之间的两个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA序列进序列进行扩增。所扩增的行扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辩，扩增带多酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辩，扩增带多为显性表现。为显性表现。5锚定引物锚定引物 3锚定引物锚定引物 NNNN（CA）n （CA）n NN CACACACACACA G

24、TGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA NN n（CA）（CA）n NNNN 3 锚定引物锚定引物 5锚定引物锚定引物 3 3 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物的的的的PCRPCR产物产物产物产物5 5 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物的的的的PCRPCR产物产物产物产物2.6 表达序列标签标记表达序列标签标记（expressed sequence tag，EST）一个基因组的所有碱基中一般只有大约一个基因组的所有碱基中一般只有大约2的碱基来组的碱基来组成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再是一种创建成编码蛋白质的基因，因此测序基因组已不再

25、是一种创建基因目录的有效途径。大量的实验证明，基因目录的有效途径。大量的实验证明，cDNA的大规模的大规模测序才是了解基因组的先驱。测序才是了解基因组的先驱。EST标记技术的原理是将标记技术的原理是将mRNA反转录成反转录成cDNA并克并克隆到载体构建成隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选文库后，大规模随机挑选cDNA克克隆，对其隆，对其5端或端或3端进行一步法测序，一般长度为端进行一步法测序，一般长度为300500bp，平均长度为，平均长度为360120bp。所获得序列与基因数据。所获得序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分库已知序列比较，从而获得对生物体生长

26、发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。EST标记技术也是一种相对简便和快捷鉴定大批基因表标记技术也是一种相对简便和快捷鉴定大批基因表达的技术。达的技术。EST来源于一定环境下一个组织总来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的所构建的cDNA文库。每一个文库。每一个EST代表一个表达基因的部分转录片代表一个表达基因的部分转录片段。通过对段。通过对EST序列的分析，从中可以获得大量的基因表序列的分析，从中可以获得大量的基因表达信息。达信息。EST标记分为两大类：标记分为两大类：（1）以分子杂交为基础）以分子杂交为基础的的E

27、ST标记，使用标记，使用EST本身为探针和经过不同限制性酶酶本身为探针和经过不同限制性酶酶切的基因组切的基因组DNA杂交可以产生这类标记；（杂交可以产生这类标记；（2）以）以PCR为为基础的基础的EST标记，按照标记，按照EST的序列设计引物对植物基因组的序列设计引物对植物基因组特殊区域进行特殊区域进行PCR扩增能够产生此类扩增能够产生此类EST标记。标记。EST标记的产生过程及应用标记的产生过程及应用（1）cDNA文库的构建文库的构建（2）序列分析：）序列分析：去掉载体序列得到去掉载体序列得到EST序列比较找出已知、未序列比较找出已知、未知知EST最后进行综合评价分析获得所需最后进行综合评价

28、分析获得所需EST标记标记（3）数据分析）数据分析 cDNA文库文库EST公共数据库公共数据库基因表达基因表达谱分析谱分析电脑克隆电脑克隆全长全长cDNA克隆克隆RACE2.6 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)建立在建立在RFLP和和PCR基础上的标记方法。基础上的标记方法。AFLP标记是用标记是用DNA限制性内切酶酶解具有相对性状的限制性内切酶酶解具有相对性状的两个群体的两个群体的DNA，然后对酶切产物进行选择性扩增，最后在，然后对酶切产物进行选择性扩增，最后在形成的扩增产物中发现不同。这种不同就是

29、与目的性状相连形成的扩增产物中发现不同。这种不同就是与目的性状相连锁的锁的AFLP标记。标记。AFLP原理AFLP基本步骤是：基本步骤是：（1）基因组）基因组DNA的提取和检测；的提取和检测；（2）限制性内切酶酶切及连接；）限制性内切酶酶切及连接；酶切时一般选择两种酶（一种识别酶切时一般选择两种酶（一种识别6碱基，一种识别碱基，一种识别4碱基），酶碱基），酶切后将酶切产物与人工接头连接（人工接头为人为设计的一段双链切后将酶切产物与人工接头连接（人工接头为人为设计的一段双链DNA，包括核心区和酶切区两部分，连接前也要酶切）。在实践中，包括核心区和酶切区两部分，连接前也要酶切）。在实践中，这两步一

30、般是同时在一起反应的。这两步一般是同时在一起反应的。（3）设计引物进行扩增；）设计引物进行扩增；设计的引物包括三部分：设计的引物包括三部分：5端是与人工接头核心区互补的序列、与端是与人工接头核心区互补的序列、与限制性酶互补序列、限制性酶互补序列、3端是带有选择性碱基的黏性末端。端是带有选择性碱基的黏性末端。PCR扩增一扩增一般有两步：一是预扩增（只有一个选择性碱基）、二是选择性扩增般有两步：一是预扩增（只有一个选择性碱基）、二是选择性扩增（有两或三个选择性碱基）。（有两或三个选择性碱基）。（4）在测序胶上分开这些扩增产物并检测其多态性。）在测序胶上分开这些扩增产物并检测其多态性。荧光标记全自动

31、荧光标记全自动AFLP原理与方法原理与方法For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLP3 果树分子标记研究现状果树分子标记研究现状RAPD：所有果树：所有果树SSR：柑橘类、柚类、果梅、柿：柑橘类、柚类、果梅、柿ISSR：柑橘类、柚类、李、杏、杨梅、波萝、罗汉果：柑橘类、柚类、李、杏、杨梅、波萝、罗汉果AFLP：柑橘类、柚类、扁桃、苹果、海棠、荔枝、芒果、桃：柑橘类、柚类、扁桃、苹果、海棠、荔枝、芒果、桃EST：柑橘类：柑橘类4 DNA分子标记在果树方面的应用分子标记在果树方面的应用4.1 亲缘关系和遗传多样性的研究亲缘关系和遗传多样性的研究4.2 D

32、NA 指指纹的建立纹的建立 （1）新品种登记和品种鉴定，主要作为该品种的专有）新品种登记和品种鉴定，主要作为该品种的专有“代号代号”，保护新育成的品种及育种家的权益；（保护新育成的品种及育种家的权益；（2）品种纯度和重复性检验；）品种纯度和重复性检验；（3）品种分类研究）品种分类研究根据各品种根据各品种DNA 指纹的差异程度可判断品种间亲指纹的差异程度可判断品种间亲缘关系远近。缘关系远近。4.3 遗传图谱的构建遗传图谱的构建 遗传图谱遗传图谱(genetic linkage map)是通过遗传重组交换结果进行连是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图锁分析所得到

33、的基因在染色体上相对位置的排列图。4.4 基因定位基因定位4.5 分子标记的辅助育种分子标记的辅助育种5 DNA分子标记辅助选择育种技术分子标记辅助选择育种技术 植物育种包括两方面的重要工作，首先是确定育种植物育种包括两方面的重要工作，首先是确定育种材料中是否存在有用的遗传变异，其次是采用有效的方材料中是否存在有用的遗传变异，其次是采用有效的方法把目标基因转移到品种中。利用易于鉴定的遗传标记法把目标基因转移到品种中。利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的常用手来辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的常用手段。段。近二十年来迅速发展起来的近二十年来迅速发展起来的DNA

34、分子标记技术给分子标记技术给育种提供了新的途径，这就是所谓的育种提供了新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助选分子标记辅助选择育种技术（择育种技术（marker-assisted selection，MAS）”。但此处不包括利用分子标记进行优异种质的但此处不包括利用分子标记进行优异种质的鉴定筛选、亲本的确定、遗传材料的鉴定和分析、鉴定筛选、亲本的确定、遗传材料的鉴定和分析、亲本遗传多样性的分析和亲缘关系的分析等，而亲本遗传多样性的分析和亲缘关系的分析等，而是指把分子标记技术应用于育种过程之中，通过是指把分子标记技术应用于育种过程之中，通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来分析与目的基因紧

35、密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。进行育种，从而达到提高育种效率的目的。5.1 生物性状及其分子标记方法生物性状及其分子标记方法5.1.1 生物性状及其类型生物性状及其类型 生物性状是生物体所表现的形态结构特征和生理生化特征。生物性状是生物体所表现的形态结构特征和生理生化特征。5.1.1.1 质量性状（质量性状（qualitative character）质量性状是指分离群体中表现为不连续变异而显示质的差异的性状。质量性状是指分离群体中表现为不连续变异而显示质的差异的性状。植物的抗病性、抗虫性和某些抗逆性（抗盐、抗旱）等性状表现为质量植物的抗病性、抗虫性和某些抗逆

36、性（抗盐、抗旱）等性状表现为质量性状遗传。性状遗传。质量性状一般具显隐性，在分离世代无法通过表型来识别目的基因质量性状一般具显隐性，在分离世代无法通过表型来识别目的基因的位点是否纯。在几对基因共同作用相同时，无法识别哪些基因在起作的位点是否纯。在几对基因共同作用相同时，无法识别哪些基因在起作用。用。5.1.1.2 数量性状（数量性状（quatitative character）数量性状是指分离群体内表现为连续变异而不显示质的差异的性状。数量性状是指分离群体内表现为连续变异而不显示质的差异的性状。产量性状、成熟期、开花期、品质等性状属于数量性状遗传。产量性状、成熟期、开花期、品质等性状属于数量性

37、状遗传。数量性状易受外界环境条件影响，选择周期长，效果差。数量性状易受外界环境条件影响，选择周期长，效果差。5.1.2 质量性状的分子标记方法质量性状的分子标记方法5.1.2.1 近等基因系（近等基因系（near isogenic,NIL）分析法）分析法 近等基因系是一组遗传背景相同或者相近，仅仅在个别染色体区段近等基因系是一组遗传背景相同或者相近，仅仅在个别染色体区段上有差异的标记体系，是一系列回交过程的产物。轮回亲本（受体）和上有差异的标记体系，是一系列回交过程的产物。轮回亲本（受体）和非轮回亲本（供体）杂交得到轮回亲本的近等基因系。非轮回亲本（供体）杂交得到轮回亲本的近等基因系。如果近等

38、基因系与轮回亲本的标记基因型不同，而与非轮回亲本的如果近等基因系与轮回亲本的标记基因型不同，而与非轮回亲本的标记基因型相同，那么该分子标记可能和目标基因连锁。标记基因型相同，那么该分子标记可能和目标基因连锁。5.1.2.2 分离体分组混合分析（分离体分组混合分析（bulked segregation analysis,BSA）法）法 BSA法的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状（如抗法的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状（如抗病和染病）分成两组，在每组群体中把各个个体的病和染病）分成两组，在每组群体中把各个个体的DNA等量混合，形等量混合，形成两个成两个DNA混合池。混合池。因

39、此又称为近等基因池法。它克服了许多植物因此又称为近等基因池法。它克服了许多植物不易获得近等基因系的缺点。不易获得近等基因系的缺点。5.1.3 数量性状的分子标记方法数量性状的分子标记方法 数量性状的分子标记为研究数量性状的遗传基础提供了可能，控制数数量性状的分子标记为研究数量性状的遗传基础提供了可能，控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因位点（量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因位点（quantitative trait locus，QTL）。）。QTL是指控制某一性状的所以基因的集合，在作物中往往与很多重要是指控制某一性状的所以基因的集合，在作物中往往与很多重要经济性状密

40、切相关。利用分子标记进行遗传连锁分析以检测出数量性状基经济性状密切相关。利用分子标记进行遗传连锁分析以检测出数量性状基因位点叫做因位点叫做QTL定位（定位（QTL mapping）。）。5.2 遗传连锁图谱的构建遗传连锁图谱的构建5.2.1 目的目的 MAS是通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因是通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判别目标基因是否存在，并对目标基因进行间接选择的一种植物选择型来判别目标基因是否存在，并对目标基因进行间接选择的一种植物选择育种方法。其原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标育种方法。其原理是利用与目标基因紧密连

41、锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少筛选过程，提高记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少筛选过程，提高育种效率的目的。育种效率的目的。由于育种目的和材料不同，育种程序也就不同，进而由于育种目的和材料不同，育种程序也就不同，进而MAS的具体方法的具体方法也会不同，但不论哪种方法，都必须构建完整的分子标记连锁图谱，即遗也会不同，但不论哪种方法，都必须构建完整的分子标记连锁图谱，即遗传连锁图谱。传连锁图谱。5.2.2 过程过程 五个步骤：五个步骤：（1）选择合适的分子标记；）选择合适的分子标记；（2）选择用于建立作图群体的亲本组合；）选择用于建立作

42、图群体的亲本组合；（3）建立作图分离群体；）建立作图分离群体；（4）测定作图群体中不同个体或者株系的标记基因型；）测定作图群体中不同个体或者株系的标记基因型；（5）对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。）对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。5.3 DNA分子标记数据的处理与分析软件分子标记数据的处理与分析软件5.2.1 数据处理数据处理 原理：以电泳图谱中带的有无来表现。因为带的有无表示研究对象原理：以电泳图谱中带的有无来表现。因为带的有无表示研究对象基因组中酶切位点或引物结合位点的有无及拷贝数的差异。基因组中酶切位点或引物结合位点的有无及拷贝数的差异。方法：采用人工读带或自

43、动图像分析系统读带的方法，有带的记方法：采用人工读带或自动图像分析系统读带的方法，有带的记为为1，无带的记为，无带的记为0，把这些数据收集起来构成数据矩阵，输入不同的，把这些数据收集起来构成数据矩阵，输入不同的软件进行分析。软件进行分析。5.2.2 常用软件常用软件 AMOVA（瑞士日内瓦大学）、（瑞士日内瓦大学）、PHYLIP（美国西雅图华盛顿大学）（美国西雅图华盛顿大学）、MEGA（美国亚利桑那州立大学）、（美国亚利桑那州立大学）、TREECON（比利时（比利时Antwerp大大学）、学）、RAPDistance（澳大利亚国立大学）、（澳大利亚国立大学）、DIPLOMO（澳大利亚国（澳大利亚国立大学）、立大学）、MAPMAKER、SPSS等。等。