生化大实验生化大实验课件1.ppt

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1、生化大实验生化大实验课件1 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验目的实验目的：通过超速离心分离血浆脂蛋白能够达到下列要求：通过超速离心分离血浆脂蛋白能够达到下列要求：v掌握超速离心技术的原理。掌握超速离心技术的原理。v熟悉差速沉降离心法熟悉差速沉降离心法、密度梯度区带离心法中的差密度梯度区带离心法中的差速区带离心法速区带离心法 和等密度区带离心法的机理、特点及和等密度区带离心法的机理、特点及应用。应用。v了解制备性离心机分为哪几类、各自的特点及应用。

2、了解制备性离心机分为哪几类、各自的特点及应用。v了解转头、离心管有哪些？各自的特点及应用。了解转头、离心管有哪些？各自的特点及应用。v了解梯度材料的选择原则及应用范围了解梯度材料的选择原则及应用范围v掌握血浆脂蛋白的分离方法。掌握血浆脂蛋白的分离方法。超速离心分离血浆脂蛋白超速离心分离血浆脂蛋白实验原理实验原理:本实验采用正常人抗凝血浆，以本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。过超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。v离心分离技术离心分离技术 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心

3、生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。细胞器及生物大

4、分子物质。v1.基本原理基本原理v离心力：离心力：当一个粒子（生物当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此转下受到离心力作用时，此离心力离心力“F”由下式定义，即：由下式定义，即：v F=ma=m2 rva 粒子旋转的加速度，粒子旋转的加速度，m 沉降粒子的有效质沉降粒子的有效质 粒子旋转的角速度，粒子旋转的角速度，r粒子的旋转半径粒子的旋转半径(cm)。v相对离心力：相对离心力：常用地球引力的倍数来表示，因而称为常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力相对离心力,RCF=ma/mg=a/g vRCF=1.119105(rpm)2 rv (r

5、pm 每分钟转数，每分钟转数，r/min)由上可见，给出旋转半径由上可见，给出旋转半径r，则，则RCF和和rpm之间可以相互换算。之间可以相互换算。若若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。v已已知知离离心心机机转转数数为为2500rpm，离离心心机机的的半半径径为为7.7cm，将将两两点点连连接接起起来来交交于于RCF标标尺尺，此此交交点点500g即是即是RCF值。值。vRCF(g)=1.11910-5rrpm2。2 离心分类离心分类根据离心原理大致可分三类。根据离心原理大致可分三类。v差速离心法差速离心法v密度梯度离心密度

6、梯度离心 1）速率区带离心法）速率区带离心法 2）等密度离心法）等密度离心法v沉降速度沉降速度:沉降速度是指在强大离心力作用沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。下，单位时间内物质运动的距离。v沉降时间沉降时间:在实际工作中，常常遇到要求在已在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的

7、时间。需的时间。v沉降系数沉降系数:根据根据1924年年Svedberg对沉降系数下的定义：对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。v S=（1/2X）（dx/dt）=d2（p-m）/18 v 1S=10-13秒秒 式中式中,d为球形粒子直径；为球形粒子直径；为流体介质的粘度；为流体介质的粘度；p为粒子的密度；为粒子的密度；m为介质的密度。为介质的密度。从该式中可看出，从该式中可看出，v（1）当）当p m，则，则SO，粒子顺着离心方向沉降。，粒子顺着离心方向沉降。v（2）当）当p=m，则，则S=0，粒子到达某一位置后达到，粒子到达某一位置后达

8、到平衡。平衡。v（3）当）当p m，则，则SO，粒子逆着离心方向上浮。，粒子逆着离心方向上浮。2.1差速沉降离心法差速沉降离心法 v采采用用逐逐渐渐增增加加离离心心速速度度或或低低速速和和高高速速交交替替进进行行离离心心，使使沉沉降降速速度度不不同同的的颗颗粒粒，在在不不同同的的离离心心速速度度及及不不同同离离心心时时间间下下分分批批分分离离的的方方法法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。2.2密度梯度区带离心法密度梯度区带离心法：v区区带带离离心心法法是是将将样样品品加加在在惰惰性性梯梯度度介介质质中中进进行行离离心心沉沉降降或或沉沉降降平平衡衡

9、，在在一一定定的的离离心心力力下下把把颗颗粒粒分分配配到到梯梯度度中中某某些些特特定定位位置置上上，形形成成不同区带的分离方法。不同区带的分离方法。v密度梯度区带离心法又可分为两种：密度梯度区带离心法又可分为两种：差速区带离心法差速区带离心法 等密度区带离心法等密度区带离心法v2.2.1差速区带离心法：差速区带离心法：不不同同的的颗颗粒粒间间存存在在沉沉降降速速度度差差时时（不不需需要要像像差差速速沉沉降降离离心心法法所所要要求求的的那那样样大大的的沉沉降降系系数数差差）。在在一一定定的的离离心心力力作作用用下下，颗颗粒粒各各自自以以一一定定的的速速度度沉沉降降，在在密密度度梯梯度度介质的不同

10、区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此此法法仅仅用用于于分分离离有有一一定定沉沉降降系系数数差差的的颗颗粒粒（20%的的沉沉降降系系数数差差或或更更少少）或或分分子子量量相相差差3倍倍的的蛋蛋白白质质，与与颗颗粒粒的的密密度度无无关关，大大小小相相同同，密密度度不不同同的的颗颗粒粒（如如线线粒粒体，溶酶体等）不能用此法分离。体，溶酶体等）不能用此法分离。离离心心后后在在近近旋旋转转轴轴处处（r1）的的介介质质密密度度最最小小，离旋转轴最远处（离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大）介质的密度最大 但但最最大大介介质质密密度度必必须须小小于于样

11、样品品中中粒粒子子的的最最小小密度，即密度，即Pm。v2.2.2等密度离心等密度离心:离离心心管管中中预预先先放放置置好好梯梯度度介介质质，样样品品加加在在梯梯度度液液面面上上，或或样样品品预预先先与与梯梯度度介介质质溶溶液液混混合合后后装装入入离离心心管管，通通过过离离心心形形成成梯梯度度，这这就就是是预预形形成成梯梯度度和和离离心心形形成成梯梯度度的的等密度区带离心产生梯度的二种方式。等密度区带离心产生梯度的二种方式。此密度梯度包含了被分离样品中所有粒子的密度。此密度梯度包含了被分离样品中所有粒子的密度。当当管管底底介介质质的的密密度度大大于于粒粒子子的的密密度度，即即mP时时粒粒子子上上

12、浮浮；在在管管顶顶处处Pm时时，则则粒粒子子沉沉降降，最最后后粒粒子子进进入入到到一一个个它它本本身身的的密密度度位位置置即即Pm，此此时时dr/dt为为零零，粒粒子子不再移动，粒子形成纯组份的区带。不再移动，粒子形成纯组份的区带。定定义义：离离心心时时，样样品品的的不不同同颗颗粒粒向向上上浮浮起起，一一直直移移动动到到与与它它们们的的密密度度相相等等的的等等密密度度点点的的特特定定梯梯度度位位置置上上，形形成成几条不同的区带。几条不同的区带。v此此法法一一般般应应用用于于物物质质的的大大小小相相近近，而而密密度度差差异较大时。常用的梯度液是异较大时。常用的梯度液是CsCl。v提提高高转转速速

13、可可缩缩短短达达到到平平衡衡的的时时间间，离离心心所所需需时时间间以以最最小小颗颗粒粒到到达达等等密密度度点点（即即平平衡衡点点）的时间为基准，有时长达数日。的时间为基准，有时长达数日。v四种血浆脂蛋白的比重：四种血浆脂蛋白的比重：此次是将血浆预先与梯度介质混合后装此次是将血浆预先与梯度介质混合后装入离心管，通过离心将整个液体形成梯度入离心管，通过离心将整个液体形成梯度,在在强大离心力作用下各脂蛋白依其自身密度不强大离心力作用下各脂蛋白依其自身密度不同而分散于相应的离心管中的密度梯度同一同而分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层，从而达到分离纯化的目的。密度层，从而达到分离纯化的目的。v操作

14、步骤操作步骤 v1血浆准备：取血库血浆血浆准备：取血库血浆250mL。v2CM和和VLDL分离：分离：v1）取约）取约250ml血浆调密度至血浆调密度至 1.019g/mL，分，分置于离心管中，加盖，用密度置于离心管中，加盖，用密度1.019g/mL液液平衡，放入平衡，放入RP50T转头，在转头，在8下下40000rpm，离心时间，离心时间20小时，小时，CM和和VLDL浮于离心管浮于离心管上层，用吸管小心吸取。上层，用吸管小心吸取。3LDL分离：分离：下层溶液加入适量的下层溶液加入适量的NaBr，调节密度至，调节密度至1.063g/mL，分置于离心管中，加盖，用密，分置于离心管中，加盖，用密

15、度度1.063g/mL液平衡，放入液平衡，放入RP50T转头，在转头，在8下下40000rpm，离心时间，离心时间20小时，小时，浮于离浮于离心管上层，用吸管小心吸取。心管上层，用吸管小心吸取。实验器材实验器材:1.超超速速离离心心机机：转转速速5000080000rpm，RCF可可达达600000g；离离心心容容量量由由几几十十ml至至2L，分分离离的的形形式式是是差差速速沉沉降降分分离离和和密密度度梯梯度度区区带带分分离离，可可进进行行亚亚细细胞胞器器分分级级分分离离，病病毒毒、核核酸酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。蛋白质和多糖等生物大分子的分离。2.角角式式转转头头：离离心心管管腔腔

16、与与转转轴轴成成一一定定倾倾角角的的转转头头。它它是是由由一一块块完完整整的的金金属属制制成成的的，其其上上有有412个个装装离离心心管管用用的的孔孔，孔孔的的中中心心轴轴与与旋旋转转轴轴间间有有2040夹夹角角，角角度度越越大大沉沉降降越越结结实实，分分离离效效果越好。果越好。v角角转转头头的的优优点点：容容量量较较大大、重重心心低低、运运转转平平衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。衡、寿命较长。是各种离心机的最高速转头。v缺缺点点：由由于于颗颗粒粒在在沉沉降降时时先先沿沿离离心心力力方方向向撞撞向向离离心心管管，然然后后沿沿管管壁壁滑滑向向管管底底，因因此此管管的的一一侧侧会会出出现现

17、颗颗粒粒沉沉积积而而产产生生“壁壁效效应应”，壁壁效效应应易易使使沉沉降降颗颗粒粒受受突突然然变变速速所所产产生生的的对对流流扰乱而影响分离效果。扰乱而影响分离效果。3.离心管离心管:主要用塑料和不锈钢制成主要用塑料和不锈钢制成塑塑料料离离心心管管的的优优点点是是透透明明（或或半半透透明明），硬硬度度小小，可可用用穿穿刺刺法法取取出出梯梯度度。缺缺点点是是易易变变形形，抗抗有有机机溶溶剂腐蚀性差，使用寿命短。剂腐蚀性差，使用寿命短。管盖有三种作用：管盖有三种作用：防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。品时，这点尤其重要。防止样品挥发

18、。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。支持离心管，防止离心管变形。4.梯度材料梯度材料:卤卤化化盐盐类类：KBr和和NaCl可可用用于于脂脂蛋蛋白白分分离离，KI和和NaI可可用用于于RNA分分离离，其其分分辨辨率率高高于于铯铯盐盐。NaCl梯梯度度也也可可用用于于分分离离脂脂蛋蛋白白，NaI梯梯度可分离天然或变性的度可分离天然或变性的DNA。超速离心机使用注意事项：超速离心机使用注意事项：1 超速离心机由专人保管专人使用，非保管人员，超速离心机由专人保管专人使用，非保管人员，严禁擅自严禁擅自 操作。操作。2 离心管要对称同量、同液、满管放置，严禁半管和空管离心管要对称同量、同液、满管放

19、置，严禁半管和空管 运转。运转。3 送样人要向操作者说明所离心的溶液是何种溶液，操作送样人要向操作者说明所离心的溶液是何种溶液，操作 者要作详细记录。者要作详细记录。4 运行前首先要平衡转头所需温度，致冷或保温。运行前首先要平衡转头所需温度，致冷或保温。5 转头放置要规范、轻放，放好后轻转转头，有速度显转头放置要规范、轻放，放好后轻转转头，有速度显 示才可正式运转。示才可正式运转。6 关、开离心机的门要轻，防止仪器移位，影响水平。关、开离心机的门要轻，防止仪器移位，影响水平。7 离心后将离心管、转头、腔体擦洗干净，规范存放。离心后将离心管、转头、腔体擦洗干净，规范存放。v作业作业v1.简述离心

20、分离血浆脂蛋白的主要方法。简述离心分离血浆脂蛋白的主要方法。v2.什么是离心力什么是离心力?什么是相对离心力什么是相对离心力?各用什么表示各用什么表示?如何转换？如何转换？v3.制备性离心机可分为几类制备性离心机可分为几类,叙述每类的特点及应叙述每类的特点及应用。用。v4.转头可分为几类转头可分为几类,每类的特点及应用。每类的特点及应用。v5.离心管可分为几类离心管可分为几类,每类的特点及应用。每类的特点及应用。v6.何谓差速沉降离心法、差速区带离心法、等密度何谓差速沉降离心法、差速区带离心法、等密度区带离心法，各自的原理是什么区带离心法，各自的原理是什么?适用于那些物质适用于那些物质的离心的离心?v7.离心技术中用于调节溶液密度梯度的材料有哪些离心技术中用于调节溶液密度梯度的材料有哪些?各有何特点？各有何特点？v8.离心操作的注意事项有那些离心操作的注意事项有那些?（普通、高速、超（普通、高速、超速）速）