不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳培训资料.ppt

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1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳http:/ 封正丁醇封正丁醇封正丁醇封正丁醇3mm3mm（观察界面，判断凝固时间）（观察界面，判断凝固时间）（观察界面，判断凝固时间）（观察界面，判断凝固时间）安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡）水、除气泡）水、除气泡）水、除气泡）http:/ 样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（样品处理并加样（20ul20ul）电泳（电泳（电泳（电泳（6mA/6mA/管，距底管，距底管，距底管，距底1cm1cm时

2、停止）时停止）时停止）时停止）剥剥剥剥胶胶胶胶 固定（时间固定（时间固定（时间固定（时间5min5min5min5min）染色（时间染色（时间染色（时间染色（时间2min2min2min2min）漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮漂洗脱色至背景透亮http:/ 二、电泳基本原理及相关知识二、电泳基本原理及相关知识 http:/ 电泳的概念电泳的概念带电粒子带电粒子（胶体颗粒、离子等）在（胶体颗粒、离子等）在电场电场的作用下在特定的的作用下在特定的介质介质中向与其电中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的分离和鉴

3、定广泛应用于生物大分子的分离和鉴定http:/ 电泳的基本原理电泳的基本原理利用物质的两个差异来分离物质利用物质的两个差异来分离物质电荷差异电荷差异电荷差异电荷差异 电荷性质电荷性质电荷性质电荷性质 电荷数量电荷数量电荷数量电荷数量分子差异分子差异分子差异分子差异 分子大小分子大小分子大小分子大小 分子形状分子形状分子形状分子形状http:/ 电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理 蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点 溶液溶液溶液溶液pHpHpHpH与蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质PIPIPIPI决定蛋白质电荷性质与数决定蛋白质电荷性质与

4、数决定蛋白质电荷性质与数决定蛋白质电荷性质与数量量量量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异不同蛋白质分子大小和分子形状的差异不同蛋白质分子大小和分子形状的差异不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 http:/ 实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）（以介质分类）纸电泳纸电泳纸电泳纸电泳 醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 http:/ 理理聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶是是由由单单体体丙

5、丙烯烯酰酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简简称称Acr)Acr)和和 交交 联联 剂剂 N,N-N,N-甲甲 叉叉 双双 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺(N(N，Nmethylene-Nmethylene-bisacylamidebisacylamide，简简称称Bis)Bis)在在加加速速剂剂N N，N N，N N，N N 四四甲甲基基乙乙二二胺胺(N(N，N N，N N，N N tetramethyl tetramethyl ethylenedia ethylenedia minemine，简简称称 TEMEDTEMED)和和 催催 化化 剂剂 过过 硫硫 酸酸 铵铵(ammo

6、nium(ammonium persulfate persulfate(NH(NH4 4)2 2S S2 2O O8 8，简简称称AP)AP)或或核核黄黄素素(ribofavin(ribofavin即即vita vita min min B B2 2，C C1717H H2020O O6 6N N4 4)的的作作用用下下聚聚合合交交联联成成三三维维网网状状结结构构的的凝凝胶胶，以以此此凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳称称为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳(polyacrylamide(polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophore

7、sis，简称，简称PAGE)PAGE)。http:/ 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6http:/ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。http:/ http:/ 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电不连续聚丙烯酰胺凝胶电不连续聚丙烯酰胺凝胶电

8、不连续聚丙烯酰胺凝胶电 泳泳泳泳的三个不连续的三个不连续的三个不连续的三个不连续 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三聚丙烯酰胺凝胶电泳的三聚丙烯酰胺凝胶电泳的三聚丙烯酰胺凝胶电泳的三 个效应个效应个效应个效应 凝胶孔径凝胶孔径凝胶孔径凝胶孔径缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHpHpH缓冲液离子成分缓冲液离子成分缓冲液离子成分缓冲液离子成分浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应http:/ 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔

9、胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。http:/ 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根(甘氨酸等电点：5.97)mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)v当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；(3)电位梯度的不连续性：分子筛效应电荷效应http:/ ht

10、tp:/ 相关理论表表表表-1-1-1-1 血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性血清中各蛋白质的相关特性种种种种 类类类类分子量分子量分子量分子量(万）万）万）万）PIPI分分分分布布布布(%)(%)清蛋白清蛋白清蛋白清蛋白 1-1-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 2-2-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白6.96.95.05.09.09.013.013.011.011.06.16.17.37.36.86.87.67.68.08.055552.130.82.130.84.172.54.172.51.2251.22515.615.6http:/ 前清蛋白前清蛋白前清蛋白前清蛋白 清蛋白清蛋白清蛋白清蛋白 2-2-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 1-1-球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白 -球球球球蛋白蛋白蛋白蛋白http:/