乳腺生物反应器复习进程.ppt

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1、乳腺生物反应器转基因动物技术转基因动物技术加快家畜加快家畜品种的改良品种的改良速度，提高肉、奶、速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，生蛋的产量和品质，生产珍贵的药用蛋白产珍贵的药用蛋白,为为大量患者造福。大量患者造福。转基因动物最诱人的前景是转基因动物最诱人的前景是作为作为生物反应器生物反应器，利用它生，利用它生产人类所需要的生物活性产产人类所需要的生物活性产品或药物，其常用方法是把品或药物，其常用方法是把目的基因在血液循环系统、目的基因在血液循环系统、唾液腺或乳腺等唾液腺或乳腺等器官或组织器官或组织中表达，从而获得人类需要中表达，从而获得人类需要的目的产物。的目的产物。根据目的蛋白根据目的蛋白

2、表表达部位达部位的不同可的不同可分为分为乳腺生物反乳腺生物反应器应器、血、血 液生物液生物 反反 应应 器器、卵、卵 生生 物物 反反 应应 器器、尿、尿 生生 物物 反反 应器、精应器、精囊腺生物反应器、囊腺生物反应器、唾液腺生物反应唾液腺生物反应器等。器等。转基因动物生产红细胞生成素（转基因动物生产红细胞生成素（EPO）将将EPO DNA分别以分别以Hind和和BamHI酶切，回酶切，回收收5.4kb的的Hind/BamHI片段，插入片段，插入pGEM-7zf(+)载体，再将载体，再将867bp的的BLG启动子插入启动子插入EPO基因之前基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体位点，构

3、建表达载体pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通过显微注射方法得。通过显微注射方法得到转基因小鼠，其乳腺中的到转基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可达含量可达0.5g/ml。20 20世纪世纪8080年代末提出动物乳腺生物反应器的设想年代末提出动物乳腺生物反应器的设想 1987 1987年，年，GordonGordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织纤溶酶原激活剂纤溶酶原激活剂(tPA)(tPA)基因。基因。1991 1991年，年，WrightGWrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因绵羊，表达水平高

4、达绵羊，表达水平高达35g/L35g/L，在世界范围内引起了极大的轰，在世界范围内引起了极大的轰动。动。1991 1991年，年，BremBrem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达 水水平达到平达到1 110g/L10g/L。1992 1992年，年，Ve-landeVe-lande：等报道了乳腺表达人：等报道了乳腺表达人C C蛋白的转基因猪，蛋白的转基因猪，表达水平达到表达水平达到1g/L1g/L以上。以上。目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶和人和人C C蛋白等基因工程产品已进入临

5、床试验阶段，并已初蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段，并已初步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。乳腺生物反应器的乳腺生物反应器的研究进展研究进展国外研究进展国外研究进展20世纪世纪80年代初，年代初，施履吉施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构院士就提出乳腺生物反应器的构 想想 ，并成功获得表达，并成功获得表达乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗原的转基因兔的转基因兔 ，为，为 我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；年，我国首次在小

6、鼠乳腺中成功地表达了人的基因；1996年年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子能在乳腺中表达人凝血因子的转基因羊。的转基因羊。2005年，国家年，国家“863”计划组利用转基因体细胞克隆技术计划组利用转基因体细胞克隆技术 ，分别获得了，分别获得了 转人乳铁蛋白、转人溶菌酶、转乳清白蛋转人乳铁蛋白、转人溶菌酶、转乳清白蛋白等转人基因白等转人基因 蛋白蛋白，其中人乳，其中人乳 铁蛋白和人铁蛋白和人-乳清白蛋白乳清白蛋白是国际上首次是国际上首次 利用转基因克隆牛而获得的。利用转基因克隆牛而获得的。虽然我国在虽然我国在该项

7、技术上取得了较大进展，但还处于探索阶段，与国外该项技术上取得了较大进展，但还处于探索阶段，与国外还有一定的差距。还有一定的差距。自国家自国家“863”计划对计划对“动物乳腺生动物乳腺生物反应器应用研究物反应器应用研究”立项后，逐步受到有关部门和企业界立项后，逐步受到有关部门和企业界的重视，研究和开发的力度加的重视，研究和开发的力度加 强，前景非常乐观。强，前景非常乐观。国内研究进展国内研究进展表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性 利用DNA重组技术的微生物来生产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工,因而生物活性低,并且具有免疫原性。产品

8、成本低产品成本低,可以大规模生产可以大规模生产 药物其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍产品质量高产品质量高,易提纯易提纯 生物活性与天然蛋白几乎完全一样,极易提纯。乳腺生物反应器的乳腺生物反应器的优点及其应用优点及其应用应用应用组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂(TPA)：由美国遗传技术公司开发的由美国遗传技术公司开发的血栓溶解剂，血栓溶解剂，1987 年年11月经联邦食品及药物管理局月经联邦食品及药物管理局(FDA)批准上市。批准上市。1988年的销售额为年的销售额为1.51.6亿美元，亿美元，1989年为年为1.81.9亿美元。今后每年的市场销售额约为亿美元。今后每年的市

9、场销售额约为22.5亿美亿美元。元。重组人抗凝血酶重组人抗凝血酶ii:世界上第一个动物乳腺生物反映器重组世界上第一个动物乳腺生物反映器重组蛋白药物。重组人抗凝血酶蛋白药物。重组人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性，具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。有显著效果。2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额达年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额达到到350 亿美元，生产的药物将占整个基因工程药亿美元，生产的药物将占整个基因工程药物种类的物种类的90%以上。以上。目的基因在动物基因中的整合

10、问题目的基因在动物基因中的整合问题 由于目的基因在动物基因中的由于目的基因在动物基因中的整合是随机的，因此包括整合是随机的，因此包括整合位点整合位点、整合整合的拷贝数的拷贝数等机制还不清楚。所以易发生调等机制还不清楚。所以易发生调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。乳腺生物反应器的乳腺生物反应器的存在的问题存在的问题转基因动物的成活率低转基因动物的成活率低 在目的基因的分离和改造，乳在目的基因的分离和改造，乳腺特异表达载体的构建及转基因技术的关腺特异表达载体的构建及转基因技术的关键性技术上存在缺陷，无法保证对键性技术上存在缺陷，无法保证对基因的基因的定点

11、整合定点整合，因此转基因动物常会出现，因此转基因动物常会出现繁殖繁殖力下降、胚胎早期死亡力下降、胚胎早期死亡等各种等各种生理及病理生理及病理缺陷缺陷 。安全性安全性 动物体内虽然可以对外源蛋白进行动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应排斥反应，如，如出现蛋白质水解等问题。出现蛋白质水解等问题。此外乳汁中可能含有的此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大的威胁，所以在分离过程中要去除所有成了极大的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能可能引起人类变态反应的蛋白质引起人类变态反应的蛋白质，同时对含量低，同时对含量低的产物加以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功的产物加以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化特性相同的产品。能和理化特性相同的产品。另外，要防止把动物另外，要防止把动物性疾病传染给人。性疾病传染给人。Thanks for your attention！