第10章-基因工程的操作过程教学内容.ppt

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1、第10章-基因工程的操作过程 一、表达载体的构建一、表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子(抗虫基因首端抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因

2、的质粒中科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入插入终止子终止子(抗虫基因末端抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。结果成长的植株，有了抗虫能力。（1 1）生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自受体生物自身基因身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；编码序列导入受体生物中无法转录；（3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中

3、需要有筛选标记；（4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置何位置(上游或下游上游或下游)上都发挥作用。上都发挥作用。）等；等；（5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如

4、绿色荧光蛋白成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因等。质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理 切口切口 黏性末端黏性末端 切口切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA（重组质粒）（重组质粒）同一种同一种2 2、过程、过程:一个一个两个两个两个两个3 3、基因、基因表达载体表达载体的组成：的组成：a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点启动子启动子目的基因目的基因复制原点复制原点终止子终止子标记基因标记基因表达载体表达载体表达载体的模式图表达载体的模式

5、图表表达达载载体体启动子启动子目的基因目的基因复制原点复制原点终止子终止子标记基因标记基因表达载体表达载体表达载体的模式图表达载体的模式图终止子：终止子：位于基因的尾端位于基因的尾端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止转录。能终止转录。标记基因：标记基因：为了鉴别受体为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，细胞中是否含有目的基因，从而从而筛选出有目的基因的筛选出有目的基因的受体细胞。受体细胞。启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转

6、驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。最终获得蛋白质。载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了 、三三部分结构部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到既用到 切割载体，切割载体，又用到又用到 将目的基因和载体拼接，将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是两种酶作用的化学键都是 。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载

7、体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意：注意：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键二、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法氯化钙法（感受氯化钙法（感受态细胞）态细胞）目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳

8、定表达表达1.将目的基因导入植物细胞uu农杆菌转化法农杆菌转化法uu基因枪法基因枪法uu花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法农杆菌：农杆菌：植物的受伤组织会产生一些糖植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。，使植物形成肿瘤。此类物质主要在双子叶植物细胞壁此类物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中中合成，通常不存在于单子叶植物中 ，农杆菌，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能物，对大多数单子叶植物没有感染能力。力。（1

9、 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 Ti Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的体细胞染色体的DNADNA上。上。原理：原理：转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因

10、与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法适用于适用于单子叶植物单子叶植物（3 3）花粉通道法）花粉通道法适用于适用于被子植物被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊子房的结构子房的结构子房壁子房壁珠被珠被珠心珠心（胚囊）（胚囊）胚胚珠珠卵细胞卵细胞极核极核 植物花粉在柱头上萌发植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是胚囊。花粉管通道法就是在在植物受粉后，植物受粉后，花粉形成的花粉形成的花花粉管还未愈合前粉管还未愈合前，剪去柱头剪去柱头，然后，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），因），使

11、目的基因借助花粉使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。管通道进入受体细胞。滴加目的基因溶液滴加目的基因溶液（3 3）花粉通道法）花粉通道法2.将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到提纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序:提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体受精卵受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫新性状动物新性状动物早期胚胎培养早期胚胎培养2.2.将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞常用法常用法：CaClCaCl2 2法法（CaCa2+2+增加细菌细胞的通透性增加

12、细菌细胞的通透性）常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.3.将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞细菌能够吸收细菌能够吸收DNADNA的状态的状态受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪

13、法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 Ca Ca2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），性细菌（如大肠杆菌等），19701970年建立此技术，年建立此技术，其原理是其原理是CaCa2+2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态细

14、菌细胞此时的状态叫做感受态 CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100 ml 100 ml 菌体培养至菌体培养至ODOD600 600=0.5 0.5，离心收集菌体，离心收集菌体 用用10 ml 10 ml 冰冷的冰冷的20 mM CaCl20 mM CaCl22溶液悬浮菌体，离心溶液悬浮菌体，离心用用1 ml 1 ml 冰冷的冰冷的100 mM CaCl100 mM CaCl22溶液悬浮菌体溶液悬浮菌体 冰浴放置冰浴放置12-2412-24小时，备用小时，备用 收集菌体收集菌体CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的

15、转化诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞的质粒转化：的质粒转化：取取100 100 m ml l 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 ng 50 ng 载体的重载体的重组组冰浴放置半小时冰浴放置半小时 在在4242保温保温 2 2 分钟（热脉冲）分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-21-2分钟分钟 DNADNA连接液，混匀连接液，混匀加入加入1 ml 1 ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养 1 1 小时（扩增）小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 细菌原生

16、质体的转化细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组法转移质粒或重组DNADNA分子分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进原生质体法进行转化行转化 电穿孔转化电穿孔转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电

17、电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细细胞胞膜膜产产生生缝缝隙隙，质质粒粒或或DNADNA重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验转化率转化率 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体为：每微克载体DNADNA在最佳转化条件下进入受体在最佳转化条件下进入受体细

18、胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNADNA转转化后，受体细胞接纳化后，受体细胞接纳DNADNA的个数，即克隆数（在的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）第二节 重组子的筛选与鉴定（一）质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选1 1、抗生素平板结合插入失活筛选法、抗生素平板结合插入失活筛选法、抗生素平板结合插入失活筛选法、抗生素平板结合

19、插入失活筛选法根据标记根据标记根据标记根据标记基因是否失活，确定是否有外源基因插入。基因是否失活，确定是否有外源基因插入。基因是否失活，确定是否有外源基因插入。基因是否失活，确定是否有外源基因插入。一、大肠杆菌重组体的筛选一、大肠杆菌重组体的筛选插入失活筛选法的应用两种情况：两种情况：1、双抗生素抗性基因标记载体、双抗生素抗性基因标记载体2、含一个抗生素抗性标记，一个、含一个抗生素抗性标记，一个lacZ基因的载体基因的载体1）双抗生素抗性标记的筛选方法uu载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一载

20、体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。uu第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长，抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不

21、能生长，可将转化子直接从平板上挑出来；可将转化子直接从平板上挑出来；可将转化子直接从平板上挑出来；可将转化子直接从平板上挑出来；uu第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一生长，重

22、组子（插入外源基因）不能生长，应与第一生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。uu如如如如pBR322pBR322质粒含有质粒含有质粒含有质粒含有TC TC r r、Amp Amp r r两个抗药两个抗药两个抗药两个抗药性基因，外源基因插入失活性基因，外源基因插入失活性基因，外源基因插入失活性基因，外源基因插入失活TC TC r r后，会有三后，会有三后，会有三后，会有三种不同表现的细胞种不同表现的细胞种不

23、同表现的细胞种不同表现的细胞:uu未转化的受体细胞未转化的受体细胞未转化的受体细胞未转化的受体细胞 TC TC s sAmp Amp s suu含载体的转化菌落含载体的转化菌落含载体的转化菌落含载体的转化菌落 Amp Ampr r TcTcr r uu含重组体的阳性菌落含重组体的阳性菌落含重组体的阳性菌落含重组体的阳性菌落AmpAmpr r TcTcs s筛选具体做法1、用转化反应液涂布含氨苄的、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长平板，长出出转化子转化子Ampr；2、用无菌牙签将、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在的转化子逐一挑在Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸影印）平板上（或用无菌丝

24、绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生长情况，从，比较两块板上的菌落生长情况，从Amp板上挑选出板上挑选出Tc板上不长的菌落即为板上不长的菌落即为重组子。重组子。注意：氨苄平板菌落密度不宜过大注意：氨苄平板菌落密度不宜过大2）蓝白斑筛选法 uu载体同时含氨苄青霉素抗性基因和载体同时含氨苄青霉素抗性基因和载体同时含氨苄青霉素抗性基因和载体同时含氨苄青霉素抗性基因和lacZ lacZ 基因，外源基因，外源基因，外源基因，外源基因插在基因插在基因插在基因插在lacZlacZ基因内，基因内，基因内，基因内，受体细胞为受体细胞为受体细胞为受体细胞为lacZ lacZ 基因互补基因互补基因互补基因互补

25、菌。菌。菌。菌。在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂在同时含氨苄青霉素和蓝白筛选显色剂（X-X-galgal）的平板上筛选：的平板上筛选：的平板上筛选：的平板上筛选：未转化细胞不能生长；未转化细胞不能生长；未转化细胞不能生长；未转化细胞不能生长；空载体转化菌长成蓝色菌落；空载体转化菌长成蓝色菌落；空载体转化菌长成蓝色菌落；空载体转化菌长成蓝色菌落；重组子长成白色菌落。重组子长成白色菌落。重组子长成白色菌落。重组子长成白色菌落。uu例：例：例：例：pUCpUC质粒系列、质粒系列、质粒系列、质粒系列、pGEMpGEM质粒系列、质粒系

26、列、质粒系列、质粒系列、M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体lacZ基因编码基因编码-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；lacZ基因编码基因编码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N端端序列序列片段片段，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者端片断，两者互补（互补（-互补）形成有功能的全酶。互补）形成有功能的全酶。蓝白筛选菌落生长照片X-galuu5-Bromo-4-Chloro-3-Indoly-D-Galactoside)，5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷uu-半乳糖苷酶显色剂：生色底物半乳糖苷酶显色剂：生色底物IPTG及其作用uuIPTGIPT

27、G：即即即即Isopropyl-Isopropyl-D-thioagalactoside-D-thioagalactoside，异，异，异，异丙基丙基丙基丙基-D-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷uu作用：乳糖操纵子诱导物，作用：乳糖操纵子诱导物，作用：乳糖操纵子诱导物，作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大和载体上携带的大和载体上携带的大和载体上携带的大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（L Lac ac I I）编码）编码）编码）编码产物产物产物产物阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，阻遏蛋白

28、结合，阻止其与操纵基因结合，阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使操纵子控制的基因（使操纵子控制的基因（使操纵子控制的基因（使操纵子控制的基因（lacZlacZ等）得以表达。等）得以表达。等）得以表达。等）得以表达。含含Lac I 的载体：如的载体：如pUC8，需要诱导物，需要诱导物不含不含Lac I 的载体：如的载体：如pUC18/19，不需诱导物，不需诱导物研究中通常为何用研究中通常为何用IPTG而非乳糖作诱导物？而非乳糖作诱导物？乳糖会被宿主细胞利用而乳糖会被宿主细胞利用而IPTG不被利用。不被利用。大肠杆菌乳糖操纵子基因组成大肠杆菌乳糖操纵子基因组成

29、IPTG2、插入表达筛选uu载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，载体的选择标记基因前连接一段负调控序列，插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达。基因才能表达。基因才能表达。基因才能表达。uu如如如如pTR262pTR262质粒，在质粒，在质粒，在质粒，在TcTc（TetTet）基因前有来自噬菌）基因前有来自噬菌）基因前有来自噬菌）基因前有来自噬菌体的体的体的体的cIcI基因，可编码基因，

30、可编码基因，可编码基因，可编码cIcI阻遏蛋白，抑制阻遏蛋白，抑制阻遏蛋白，抑制阻遏蛋白，抑制TetTet表达。表达。表达。表达。uucIcI基因（基因（基因（基因（Hind Hind或或或或BglBgl位点）插入失活，位点）插入失活，位点）插入失活，位点）插入失活，TcTc基因基因基因基因表达，受体细胞在表达，受体细胞在表达，受体细胞在表达，受体细胞在TcTc板上生长；未转化细胞及及空板上生长；未转化细胞及及空板上生长；未转化细胞及及空板上生长；未转化细胞及及空载体转化细胞载体转化细胞载体转化细胞载体转化细胞TcTc表达被抑制，在表达被抑制，在表达被抑制，在表达被抑制，在TcTc平板上不生长

31、。平板上不生长。平板上不生长。平板上不生长。（二）噬菌体（二）噬菌体DNA重组子的筛选重组子的筛选1、取代型载体：根据、取代型载体：根据基因组的大小筛选，基因组的大小筛选，直接挑取噬菌斑即重组子直接挑取噬菌斑即重组子uu机理：机理：空载体太小而不被包装，不进入细胞；空载体太小而不被包装，不进入细胞；重组重组-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染可包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌产生噬菌斑；大肠杆菌产生噬菌斑；未感染菌生长成菌落。未感染菌生长成菌落。2、插入型载体uu空载体及重组载体都可包装，需要空载体及重组载体都可包装，需要插插入失活载体上的标记基因筛选。入失活载体上的标记基因筛选。lacZ 基因插入

32、失活筛选：蓝白筛选基因插入失活筛选：蓝白筛选cI基因插入失活筛选：基因插入失活筛选：cI筛选筛选选择标记基因1）利用）利用lacZ基因的插入失活筛选重基因的插入失活筛选重组噬菌斑组噬菌斑 uu如含有如含有lacZ基因的基因的M13噬菌体及多噬菌体及多种种噬菌体载体（噬菌体载体（gt11）uu重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈蓝色，未转化细胞长出菌落呈蓝色，未转化细胞长出菌落uu原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态；cI基因的插入失活使感染了噬菌体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：

33、正常菌落Polylinker插入不影响lacZ基因表达单酶切时有这种情况噬菌斑噬菌斑2）cI基因插入失活筛选uu例：例：例：例：gt10 gt10 BNNl02 BNNl02（C600hflA C600hflA）系）系）系）系统统统统uu C600hflA C600hflA是一种是一种是一种是一种hflAhflA突变菌；突变菌；突变菌；突变菌；cIcI基因正基因正基因正基因正常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成常表达的噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑；噬菌斑；噬菌斑；噬菌斑；但但但但cIcI基因插入失活的重组噬菌体却能形

34、成基因插入失活的重组噬菌体却能形成基因插入失活的重组噬菌体却能形成基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌斑（噬菌斑（噬菌斑（噬菌斑（Young and Davis 1983aYoung and Davis 1983a）。hfL：high frequence lysogenization 二、转化/重组酵母菌的筛选u（一）营养缺陷互补基因（一）营养缺陷互补基因u（二）显性标记基因（二）显性标记基因（一）利用营养缺陷互补基因的筛选方法uu原理：原理：原理：原理：受体细胞为某种受体细胞为某种受体细胞为某种受体细胞为某种营养缺陷型突变株，营养缺陷型突变株，营养缺陷型突变株，营养缺陷型突变株，即不能合成某

35、种营养成分，在即不能合成某种营养成分，在即不能合成某种营养成分，在即不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成缺乏该营养成缺乏该营养成缺乏该营养成分的培养基上不能生长分的培养基上不能生长分的培养基上不能生长分的培养基上不能生长；uu携带相应携带相应携带相应携带相应营养成分合成基因营养成分合成基因营养成分合成基因营养成分合成基因的载体转化受体的载体转化受体的载体转化受体的载体转化受体菌后，使细胞在菌后，使细胞在菌后，使细胞在菌后，使细胞在选择培养基（不含某种相应选择培养基（不含某种相应选择培养基（不含某种相应选择培养基（不含某种相应营养物质的培养基）营养物质的培养基）营养物质的培养基）营养物质的培养基

36、）中能够生长，而未被转中能够生长，而未被转中能够生长，而未被转中能够生长，而未被转化的细胞不能生长。化的细胞不能生长。化的细胞不能生长。化的细胞不能生长。酵母常用营养标记基因uu第一类：氨基酸合成基因：第一类：氨基酸合成基因：组氨酸合成酶基因组氨酸合成酶基因HIS4色氨酸合成酶基因色氨酸合成酶基因TRP1亮氨酸合成酶基因亮氨酸合成酶基因LEU2精氨酸合成酶基因精氨酸合成酶基因 ARG4第二类：核苷酸合成基因：第二类：核苷酸合成基因：尿嘧啶合成酶基因（尿嘧啶合成酶基因（URA3）1、含HIS 的载体uu分泌型表达载体主要有：分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIc

37、za，pYAM75P6；uu胞内表达的载体主要有：胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等等 组氨醇脱氢酶基因（组氨醇脱氢酶基因（his4）缺失的毕赤酵母）缺失的毕赤酵母uu主要有三类：主要有三类：GS115、SMDI168、KM71uu均均不能合成不能合成组氨酸组氨酸uu载体需携带载体需携带his4，转染后的阳性重组子可，转染后的阳性重组子可以用不含组氨酸的以用不含组氨酸的MM平板进行筛选平板进行筛选2、含、含URA3 的载体的载体uu载体：载体：酵母菌的酵母菌的Yep系列载体：含系列载体：含Amp、Tc和和URA

38、3（尿嘧啶）标记基因（尿嘧啶）标记基因uu受体细胞：受体细胞：EGY48菌株菌株 AmpAmp、TcTc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子URA3URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选标记基因用于酵母转化细胞的筛选标记基因用于酵母转化细胞的筛选标记基因用于酵母转化细胞的筛选 （二）酵母常用显性标记基因（二）酵母常用显性标记基因1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo（neomycin）。）。2、博来霉素抗性基因博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如如pFLD

39、1载体载体1、Neo选择系统uuNeo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可以灭活氨基糖甙类抗生素，是新可以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素（霉素（neomycin）、新霉素衍生）、新霉素衍生物物G418、卡那霉素等抗生素的抗、卡那霉素等抗生素的抗药基因。药基因。2、Zeo选择系统uuZeo是编码博来霉素抗性产物的基因。是编码博来霉素抗性产物的基因。uu博来霉素（博来霉素（bleomycin）是一种广）是一种广谱抗肿瘤药。谱抗肿瘤药。（三）酵母其他显性标记基因（三）酵母其他显性标记基因1、蓝白筛选基因：、蓝白筛选基因：LacZ基因基因2、铜离子抗性蛋白基因：、铜离子抗性蛋白基

40、因：CUP1基因。编基因。编码一种铜离子螯合蛋白，适合铜离子敏码一种铜离子螯合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。感菌（如酿酒酵母）的筛选。3、赭石突变抑制基因：、赭石突变抑制基因：sup4利用赭石突变抑制基因 sup4筛选重组酵母菌uu酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌AB1380AB1380（与（与（与（与 YAC YAC 载体配套）的载体配套）的载体配套）的载体配套）的胸腺嘧啶合成胸腺嘧啶合成胸腺嘧啶合成胸腺嘧啶合成酶基因带有一个赭石突变酶基因带有一个赭石突变酶基因带有一个赭石突变酶基因带有一个赭石突变 ade ade 2-12-1，使其在基本培养基使其在基本培养基使其在基本培养基使其在基

41、本培养基上形成上形成上形成上形成红色菌落，红色菌落，红色菌落，红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上但在缺少某种营养素的选择培养基上但在缺少某种营养素的选择培养基上但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生长。不能生长。不能生长。不能生长。uu当带有当带有当带有当带有赭石突变抑制基因赭石突变抑制基因赭石突变抑制基因赭石突变抑制基因 supsup4 4 的空载体存在于细胞中的空载体存在于细胞中的空载体存在于细胞中的空载体存在于细胞中时，可抑制时，可抑制时，可抑制时，可抑制 ade ade 2-12-1基因的突变效应，该酵母菌在选择基因的突变效应，该酵母菌在选择基因的突变效应，该酵母菌在选择基因的

42、突变效应，该酵母菌在选择培养基上形成正常的培养基上形成正常的培养基上形成正常的培养基上形成正常的白色菌落；白色菌落；白色菌落；白色菌落；uu supsup4 4被外源基因插入失活后重组子呈红色被外源基因插入失活后重组子呈红色被外源基因插入失活后重组子呈红色被外源基因插入失活后重组子呈红色。YAC 载体带有trp 1、leu 2和 his 3、ura3 以及 sup4密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变三、重组子的鉴定uu核酸分子杂交法核酸分子杂交法uu裂解细菌电泳鉴定分子大裂解细菌电泳鉴定分子大小小uu限制性内切酶法限制性内切酶法uuPCR法法uu基因产物检测法基因产物检测法uu序列分析序

43、列分析（一）核酸分子杂交筛选法 1、Southern印迹杂交：印迹杂交：用标记的核酸探针检测目的基因存在与否用标记的核酸探针检测目的基因存在与否uu步骤：步骤：步骤：步骤：1 1、用内切、用内切、用内切、用内切酶酶酶酶消化重消化重消化重消化重组组组组子子子子22、凝胶、凝胶、凝胶、凝胶电电电电泳分离泳分离泳分离泳分离33、印迹到硝酸、印迹到硝酸、印迹到硝酸、印迹到硝酸纤维纤维纤维纤维素膜上素膜上素膜上素膜上44、用、用、用、用标记标记标记标记的的的的DNADNA探探探探针杂针杂针杂针杂交，若有交，若有交，若有交，若有带显带显带显带显示，示，示，示，说说说说明其来源明其来源明其来源明其来源细细细

44、细胞胞胞胞为为为为阳性重阳性重阳性重阳性重组组组组体。体。体。体。Southern印迹杂交（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。出阳性菌落。（2）R-环检测法环检测法DNA-RNADNA-RNA杂交。用外源基因的杂交。用外源基因的杂交。用外源基因的杂交。用外源基因的mRNAmRNA与重组载体与重组载体与重组载体与重组载体杂交。电镜下可见一种杂交。电镜下可见一种杂交。电镜下可见一种杂交。电镜下可见一种R-R-环形结构。环形结构。环形结构。环形结构。uu用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品。样品。u

45、u主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。2.Northern blotting（Northern 杂交交）（二）电泳筛选重组子（二）电泳筛选重组子uu是从初筛的转化子中进一步筛出重组子是从初筛的转化子中进一步筛出重组子是从初筛的转化子中进一步筛出重组子是从初筛的转化子中进一步筛出重组子的方法。的方法。的方法。的方法。uu依据：重组载体与空载体依据：重组载体与空载体依据：重组载体与空载体依据：重组载体与空载体DNADNA大小不大小不大小不大小不同，在同一电场的迁移率也不同同，在同一电场的迁移率也不同同，在同一电场的迁移率也不同同，在同一电场的迁移率也不同适用于插入片段较大的重组

46、子筛选适用于插入片段较大的重组子筛选适用于插入片段较大的重组子筛选适用于插入片段较大的重组子筛选（重组子与载体电泳迁移率差别较明显）（重组子与载体电泳迁移率差别较明显）（重组子与载体电泳迁移率差别较明显）（重组子与载体电泳迁移率差别较明显）电泳鉴定分子大小法筛选重组子的步骤 （三）限制性内切酶法uu原理：外源片段通过特定的酶切位点插原理：外源片段通过特定的酶切位点插原理：外源片段通过特定的酶切位点插原理：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以用这些限制性入到载体上，因此，可以用这些限制性入到载体上，因此，可以用这些限制性入到载体上，因此，可以用这些限制性酶切割提取的质粒酶切割提取的

47、质粒酶切割提取的质粒酶切割提取的质粒DNADNA，电泳分析插入，电泳分析插入，电泳分析插入，电泳分析插入片段。片段。片段。片段。用途：用途：用途：用途：1 1、区分期望重组子和非期望重组子、区分期望重组子和非期望重组子、区分期望重组子和非期望重组子、区分期望重组子和非期望重组子2 2、判断插入的、判断插入的、判断插入的、判断插入的DNADNA分子质量分子质量分子质量分子质量3 3、判断平末端连接的插入方向、判断平末端连接的插入方向、判断平末端连接的插入方向、判断平末端连接的插入方向（四）PCR法uu原理：根据插入DNA片段设计特异性引物，以小量抽提的转化子DNA为模板，进行PCR反应，能扩增出

48、特异片段的转化子为携有目的基因的重组子。uu应用：1、鉴定重组子 2、鉴定插入片断方向PCR引物设计示意图引物设计示意图 引物仅与载体上外源基因两侧序列或外源基因序列互补时，只能判断插入片段有无及大小而不能判断插入片段方向；引物与载体上外源基因两侧序列及部分外源基因序列同时互补时，既可检测插入片段有无及大小，又可检测插入方向。（五）蛋白表达检测法uuSDS-PAGEuuWestern BlotuuELISA1、SDS-PAGEuu原理：原理：原理：原理：根据对表达蛋白的大小的了解，根据对表达蛋白的大小的了解，根据对表达蛋白的大小的了解，根据对表达蛋白的大小的了解，电泳后考马氏亮兰染色观察有无期

49、望电泳后考马氏亮兰染色观察有无期望电泳后考马氏亮兰染色观察有无期望电泳后考马氏亮兰染色观察有无期望带出现带出现带出现带出现uu应用：应用：应用：应用：初步检测表达量比较高的蛋白初步检测表达量比较高的蛋白初步检测表达量比较高的蛋白初步检测表达量比较高的蛋白（1mg/L1mg/L）uu方法：方法：方法：方法：制备重组细胞和非重组细胞的制备重组细胞和非重组细胞的制备重组细胞和非重组细胞的制备重组细胞和非重组细胞的蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后用考马氏亮蓝染色；对比电泳结果，用考马氏亮蓝染色；对比电泳结果

50、，用考马氏亮蓝染色；对比电泳结果，用考马氏亮蓝染色；对比电泳结果，判断有无外源蛋白表达。判断有无外源蛋白表达。判断有无外源蛋白表达。判断有无外源蛋白表达。（聚丙烯酰胺凝胶电泳）（聚丙烯酰胺凝胶电泳）（聚丙烯酰胺凝胶电泳）（聚丙烯酰胺凝胶电泳）SDS-PAGE2、Western Blot（免疫免疫印迹法）uu又称又称又称又称蛋白质免疫印迹（蛋白质免疫印迹（蛋白质免疫印迹（蛋白质免疫印迹（immunoblottingimmunoblotting）uu原原原原理理理理：先先先先通通通通过过过过SDS-PAGESDS-PAGE使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白分分分分开开开开，然然然然后后后后转转转转移移移移到