附主要参考文献摘要.doc
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1、附主要参考文献摘要Prevention of UV radiationinduced immunosuppression by IL-12 is dependent on DNA repair译文:IL-12的DNA修复作用可以预防紫外线照射导致的免疫抑制IL-12的DNA修复作用可以预防紫外线照射导致的免疫抑制摘要:IL-12是一种具有免疫刺激功能的细胞因子,它可以对抗太阳或是紫外线辐射导致的免疫抑制,但是机制还不清楚。最近的研究发现IL-12具有诱导脱氧核糖核酸(DNA)修复的作用。紫外线辐射可以导致DNA损伤,这是紫外线导致免疫抑制的重要分子基础。因此,我们进行了IL-12的免疫修复实验
2、,以便了解它的作用是否与DNA修复有关。IL-12可以防止紫外线导致的接触性超敏反应抑制状态,朗格汉湿细胞(LC)是皮肤中主要的抗原提呈细胞(APC),紫外线可以导致这些细胞的损伤,而IL-12可以恢复野生型小鼠的LC功能,但是不能恢复DNA修复缺陷型小鼠的LC功能。相反,在紫外线辐射已经造成免疫耐受的情况下,IL-12能够打破免疫耐受,抑制调节性T细胞的活性,这种作用不依赖于DNA修复。这些数据证实IL-12可以通过一种新的机制恢复免疫反应,也表明IL-12预防紫外线导致的免疫抑制与DNA修复之间有联系。 紫外线辐射,尤其是中等波长范围(UVB,290320nm)的辐射,是影响人体最重要的环
3、境因素之一。它对人体健康的损害表现为:加重感染性疾病,皮肤癌,皮肤老化。这些损害一方面是由于紫外线具有免疫抑制的特性,这可以通过紫外线抑制细胞免疫反应的实验进行证明,如抑制接触性超敏反应,在紫外线照射过的皮肤区域,可以使皮肤接触变应原的敏感性降低。另一方面,紫外线激活了抑制性/调节性T细胞,使皮肤对半抗原产生特异性免疫耐受。细胞因子IL-12是协调固有性免疫反应和获得性免疫反应的主要物质之一。IL-12对产生Th1型反应至关重要。此外,IL-12能够预防紫外线导致的免疫抑制。在暴露于紫外线的皮肤上敷贴半抗原,此前注射过IL-12可以预防免疫抑制的出现。更为重要的是,IL-12可以打破已经形成的
4、免疫抑制状态,拮抗调节性T细胞的抑制活性。但是,IL-12预防紫外线导致免疫抑制状态的机制仍未清楚。紫外线导致DNA损伤,尤其是使皮肤产生环丁烷嘧啶二聚体(CPD),被认为是紫外线导致免疫抑制的重要激发分子。通过DNA修复酶的作用可以还原CPD,从而阻断紫外线诱发的免疫抑制。最近的观察发现,IL-12除了具有免疫调节活性外,还显示出具有消除紫外线导致DNA损伤的能力。但是在Xpa KO(Xpa/)小鼠上却没有出现这种作用,这是由于这种小鼠的Xpa基因发生了突变,缺乏功能性的核苷酸切除修复(NER)功能,NER是体内的一种DNA修复系统,可以消除紫外线导致的DNA损伤。这些现象表明IL-12可以
5、通过诱导NER而清除CPD。因此我们对IL-12预防紫外线导致的免疫抑制作用,是否是由于它可以诱导DNA修复很感兴趣。我们假设这种情况是成立的,那么在DNA修复缺陷型小鼠上IL-12将不能阻止紫外线造成的免疫抑制。结果和讨论IL-12可以在野生型(WT)小鼠上预防紫外线抑制接触性超敏反应(CHS),但是对Xpa/小鼠无作用C57BL/6小鼠和Xpa/小鼠暴露于紫外线,在最后一次暴露后,在暴露的皮肤区域局部涂抹2,4-二硝基氟苯(DNFB)使小鼠过敏。在紫外线暴露区域的皮肤涂抹DNFB,在野生型(WT)小鼠和Xpa/小鼠上都没有诱发超敏反应(图1)。在涂抹DNFB以前3小时注射IL-12,在WT
6、小鼠紫外线暴露的耳部皮肤区域可以恢复致敏性,表现为强烈的CHS反应(图1A)。相反,在Xpa/小鼠上注射IL-12以后,紫外线暴露区域仍然对DNFB没有反应(图1B)。表明IL-12预防紫外线导致的免疫抑制可能依赖于功能性的NER。IL-12打破紫外线在WT小鼠和Xpa/小鼠上诱生的免疫耐受在紫外线暴露的皮肤上使用半抗原,不仅会抑制CHS,而且会导致半抗原特异性的免疫耐受。因此,在之前涂抹过半抗原的WT和Xpa/小鼠紫外线暴露处的皮肤上,使用DNFB再次致敏时,没有出现耳部皮肤的肿胀现象,表明WT和Xpa/小鼠可能对DNFB产生了耐受(图2)。IL-12是唯一具有打破已形成免疫耐受的细胞因子。
7、在再次致敏前3小时注射IL-12,可以完全恢复WT和Xpa/小鼠对DNFB刺激的致敏反应,表明IL-12可以同时打破紫外线所致WT和Xpa/小鼠的免疫耐受。因此,与IL-12预防紫外线诱发的免疫抑制相比,IL-12打破紫外线诱发的免疫耐受不依赖于功能性的NER。IL-12对WT和Xpa/小鼠上过继转移耐受的作用 紫外线诱发的免疫耐受可以通过向受体小鼠尾静脉注射T细胞的方式,过继转移到未处理过的受体小鼠体内,使受体小鼠也产生免疫耐受。表明在紫外线暴露的皮肤上涂抹半抗原,可以诱发半抗原特异性的调节性T细胞(Treg细胞)。IL-12不仅可以阻止紫外线诱生Treg细胞,还能够消除这些细胞的抑制活性。
8、为了确定IL-12的这两种作用是否与IL-12的DNA修复功能有关,进行了过继转移的研究。之前在两种小鼠系暴露于紫外线的皮肤上涂抹DNFB,诱发了免疫耐受,收集这两种小鼠的淋巴结细胞。将这些细胞注射到同源基因的受体小鼠体内,使得这些受体小鼠对DNFB没有反应性(图3,A和B,第3组)。来源于注射过IL-12供体小鼠的细胞,转移后在WT型小鼠上没有出现抑制现象(图3A,第4组),相反,过继转移的细胞如果来源于相同处理的Xpa/供体小鼠,则会在Xpa/受体小鼠上产生耐受(图3B,第4组)。这些现象表明IL-12可以在WT小鼠上阻止紫外线诱生Treg细胞,但是对Xpa/小鼠无此作用。IL-12也显示
9、出具有抑制紫外线诱发的Treg细胞活性的作用,通过过继转移实验可以证明这一点,如果受体小鼠接受过IL-12的治疗,接受Treg细胞过继转移后不会出现抑制现象。为此,在过继转移Treg细胞到相应的受体小鼠系之前3小时,受体小鼠腹腔内注射IL-12,过继转移后24小时再次注射IL-12。24小时后,受体小鼠采用DNFB致敏。转移Treg细胞后在两种小鼠上产生的抑制作用,都被IL-12所阻断(图3,A和B,第5组),提示IL-12可以在WT小鼠和Xpa/小鼠上拮抗Treg细胞的抑制活性。IL-12阻止紫外线诱发的清除朗格汉湿细胞(LC)紫外线抑制CHS的一个重要原因就是诱使LC被清除,LC是表皮上关
10、键的抗原提呈细胞(APC)。最初认为表皮上的LC消失是由于紫外线照射后,诱使LC凋亡的缘故。但是最近的证据表明紫外线诱发LC的清除,主要是由于LC从皮肤游走到淋巴结的结果。相应的,暴露于紫外线的小鼠输出淋巴结上,可以发现包含有CPD的APC。可以鉴别出这些APC来源于表皮,并且这些细胞的抗原提呈功能受到削弱。DNA修复酶清除CPD以后可以恢复这些细胞的免疫刺激功能。提示紫外线诱使DNA损伤,是引起LC从表皮游走的主要激发过程,并且在淋巴结处,由于受到紫外线损伤的LC提呈抗原诱生了Treg细胞,最终导致免疫耐受。为此,我们接着研究了IL-12能否预防紫外线导致的LC清除,并且这种作用是否与DNA
11、修复有关。WT和Xpa/小鼠的耳朵暴露于紫外线下。其中的一组小鼠在致敏前3小时注射IL-12。48小时后制备小鼠耳朵的切片,计算LC的数量。紫外线导致WT和Xpa/小鼠的LC数量明显降低(图4)。注射IL-12的WT小鼠,紫外线照射区域皮肤上大部分的LC得以保存。相反,在Xpa/小鼠上无法阻止LC被清除。 IL-12在淋巴结处减少DNA受损APC的数量有证据表明紫外线诱使DNA损伤,是引起LC向输出淋巴结迁移的主要分子激发过程。紫外线还削弱了这些细胞的抗原提呈功能,反映到机体就是缺乏致敏作用和诱发耐受。知道了IL-12具有诱发NER的能力后,我们接着开始进行下一步的研究,探讨IL-12能否减少
12、输出淋巴结处CPD阳性的细胞数量。在WT和Xpa/小鼠受到紫外线照射的皮肤区域涂抹DNFB,其中的一组在使用半抗原3小时以前注射IL-12。48小时后,采用磁珠分离法从输出淋巴结处收集CD11c阳性的细胞。将这些细胞采用LC特异性标记Langerin的单抗染色,另一个染色是直接结合CPD的标记,接着采用流式细胞仪分析这些细胞。没有处理过的小鼠淋巴结处几乎没有检测出Langerin阳性细胞(图5)。致敏后导致表达Langerin的细胞数量增加。对WT和Xpa/小鼠进行紫外线照射和致敏后,可以检测到大部分Langerin阳性细胞的CPD染色也是阳性的。在注射过IL-12的WT小鼠上,这种双阳性细胞
13、的数量明显降低。相反在注射过IL-12的Xpa/小鼠上,淋巴结处含有CPD的LC数量并没有降低。这些现象提示IL-12能够在淋巴结处清除CPD主要依赖于NER的作用。同时,这些数据也提示IL-12预防紫外线导致的免疫抑制,有可能是通过诱导NER清除紫外线诱发的DNA损伤。结论IL-12不仅可以阻止紫外线诱导的免疫抑制,也能够打破已形成的免疫耐受。这里的发现支持了IL-12通过不同的机制介导这两种作用。IL-12能够预防紫外线导致的免疫抑制,看来是由于它具有诱导NER的能力,以及清除紫外线诱发DNA损伤的能力。相反,IL-12抑制紫外线诱生的Treg细胞活性似乎不依赖于这种能力,因为在Xpa/小
14、鼠上IL-12只是预防免疫抑制的作用降低,但是它打破免疫耐受的效果没有被削弱。Xpa基因是NER的关键组成单位。因此Xpa/小鼠的NER功能严重缺陷。因为紫外线导致DNA损伤被认为是诱导凋亡的主要分子激发机制,而Xpa/小鼠消除紫外线导致的DNA损伤的能力被削弱,所以在长期的紫外线暴露下,Xpa/小鼠表皮凋亡的角质形成细胞数量要多于WT小鼠,Xpa/小鼠发展到紫外线诱发的皮肤癌的风险也较高。Xpa/小鼠对紫外线诱发的免疫抑制更为敏感,与WT小鼠产生同样程度的免疫抑制,Xpa/小鼠暴露于紫外线的量要低于WT小鼠。这也支持了紫外线导致DNA损伤是紫外线介导免疫系统功能受损的主要分子机制。因为对于紫
15、外线导致的CHS抑制和LC迁移,以及降低输出淋巴结处CPD阳性细胞的数量,IL-12对Xpa/小鼠的治疗作用不明显,所以我们可以得出这样的结论:IL-12通过NER才能产生作用。除了消除DNA损伤的能力削弱以外,Xpa/小鼠和WT小鼠是相似的。然而,还必须考虑到Xpa/小鼠与WT小鼠对IL-12的反应能力可能存在差异。但是这种可能性似乎不大,因为在Xpa/小鼠和WT小鼠中,IL-12都能完全打破已形成的免疫耐受,抑制Treg细胞的活性。在这种情况下,可以说DNA损伤对最初诱导Treg细胞产生很重要,但是Treg细胞的抑制活性并不依赖于DNA损伤,因为在体内环境下Treg细胞从未暴露于紫外线的辐
16、射下。IL-12诱发NER的机制仍未清楚。虽然IL-12已经显示出能够在RNA水平诱导NER的组成单位,但是在蛋白质水平这些数据尚未得到确定。而且IL-12对全基因组修复或是转录偶联修复的作用也不清楚。因为后者与紫外线导致LC清除和局部免疫抑制有关,因此可以直接得出的结论是IL-12至少影响转录偶联修复。此外,我们还没有分析出IL-12通过何种信号机制诱导DNA修复。S TAT-4是IL-12信号转导中的主要蛋白,采用STAT-4/细胞有助于回答STAT-4是否参与了信号转导的问题。观察表明IL-12可以预防紫外线诱发角质形成细胞凋亡,提示角质形成细胞表达IL-12的受体。IL-12的受体由两
17、个亚单位组成,分别命名为1和2。PCR和流式细胞分析小鼠的上皮细胞和转化的角质形成细胞系PAM-212,这两种细胞同时表达IL-12受体的两种链(数据未公布)。因此,就提出了这样的问题, IL-12阻止紫外线诱导的免疫抑制是通过角质形成细胞还是LC或两者同时介导的。Xpa/小鼠来源的LC和BM的嵌合体是阐明这一问题的理想工具。在这些嵌合体中,IL-12无法阻止紫外线诱发的免疫抑制,提示LC是IL-12的主要靶细胞。然而,Merad等最近报道BM移植后的小鼠,接受致死量照射,宿主来源的LC仍然存活至少18个月,相反其他器官的DC几乎都在2个月内被供体细胞完全取代。只有在高剂量的紫外线暴露下LC才
18、会消失,并被循环中的LC前体细胞取代。但是高剂量的紫外线导致全身的免疫抑制。因此,很难分析免疫抑制的作用究竟是最初暴露的紫外线量清除了宿主的LC,还是后面的暴露量影响了供体LC。我们目前正试图确定清除供体LC,但是不会引起全身免疫抑制的紫外线暴露量。紫外线导致DNA损伤是介导光照致免疫抑制的主要分子机制。我们的发现提示这种调节不是单向的,因为像IL-12一类的细胞因子可以调控DNA修复,从而具有拮抗紫外线导致的免疫抑制作用。基于目前发现的数据,似乎可以得出这样的结论:IL-12的免疫重建活性,可能部分是由于它具有诱导DNA修复的能力。因为紫外线诱使DNA损伤是光致癌作用的关键步骤,这种相互作用
19、代表了一种新的防御机制,这种防御机制帮助宿主对抗紫外线诱导的免疫抑制和致癌作用。此外,这些数据还确定了IL-12恢复免疫反应的一种新机制,并首次证明IL-12预防紫外线诱导的免疫抑制和DNA修复之间的联系。因为紫外线诱导DNA损伤和免疫抑制在光的致癌作用中起到重要作用,应用IL-12防治紫外线导致的癌症当今最常见的恶性肿瘤之一,值得进一步研究。材料和方法动物 C57BL/6小鼠从Harlan-Winkelmann购买。在RIVM生产Xpa/小鼠。由专职人员按照相关的法律和指导方针伺养动物。采用无菌隔离内毒素的生理盐水稀释rIL-12,每只小鼠通过腹腔注射1000ng。CHS 在第0天致敏,采用
20、50l DNFB溶液(浓度0.5,溶于丙酮/橄榄油,4:1)涂抹于背部剃过毛的小鼠。第5天,浓度为0.3的DNFB20l涂抹于左耳处。24小时后采用弹簧测微计定量耳部的水肿程度。CHS的程度定义为:采用半抗原刺激的耳朵厚度与未刺激耳朵的厚度的比较,数据记录为cm103(平均数标准差)。再次致敏的方法为:第一次致敏14天后于腹部皮肤处。再次致敏后5天进行第二次刺激,部位为右耳。每组至少7只小鼠。每次实验至少进行2次。紫外线照射 背部剃过毛的小鼠暴露于紫外线下,由荧光灯(Philips)产生的紫外线能量范围集中于UVB区域。小鼠每天暴露于紫外线下,连续4天。每只WT小鼠的暴露量为1000J/m2。
21、因为Xpa/小鼠对紫外线更为敏感,所以它们接受的暴露量为400 J/m2,使其达到与WT小鼠同样水平的免疫抑制。过继转移免疫反应 供体小鼠的处理方法如上所述,收集脾和局部淋巴结,制备单细胞悬液。每只受体小鼠静脉注射200l(2.5108/ml),24小时后采用DNFB致敏。5天后,刺激小鼠左耳,24小时后测量耳部的肿胀程度。未经处理的受体小鼠注射过这种细胞后,CHS受到抑制,而且是半抗原特异性的方式,提示在这些细胞群中有Treg细胞。为了简化实验设计,我们从紫外线诱导免疫耐受的小鼠上收集淋巴结细胞,代替紫外线诱生的Treg细胞条件,虽然我们注意到了注射的不是纯Treg细胞,但是注射的细胞群中含
22、有Treg细胞。免疫荧光染色 采用机械方法将小鼠耳朵分离为背侧面和腹侧面,于2mM的EDTA中培养,PBS洗涤,加入丙酮。采用抗-A/-E单抗(BD Biosciences)染色过夜,采用偶联有Texas红的的第二抗体抗鼠单抗(IgG)孵育,用显微镜检测(BX61型;Olympus)。流式细胞仪检测 采用磁珠分离法(autoMACS;Miltenyi Biotec)富集来源于脾和淋巴结的CD11c阳性细胞。PBS洗涤,0.8多聚甲醛4下孵育5分钟。洗涤,0.3的冰皂苷孵育5分钟。偶联有抗鼠Oregon绿的Langerin直接结合抗体(Hybridoma 929F3;Schering-Ploug
23、h),偶联有抗鼠FITC抗体的CPD直接结合抗体(Kamiya Biomedical Company),与细胞一起在室温下孵育30分钟。用流式细胞仪(FACS Calibur;BD Biosciences)分析样本。数据分析 采用Students t 检验分析数据,规定P0.05为显著性差异。附:图1 IL-12阻止紫外线诱导的WT小鼠CHS抑制状态,对Xpa/小鼠无效C57BL/6(A)或者Xpa/小鼠(B)每日用紫外线照射(分别为1000和400J/m2)背部,时间为4天,在最后一次照射24小时后,致敏紫外线暴露的皮肤区域(第3组和第4组)。5天后,刺激小鼠的左耳,24小时后测量耳部的肿胀
24、度。第4组在致敏前3小时注射1000ng的IL-12。阳性对照组的小鼠进行致敏和刺激(第1组),阴性对照的动物只是刺激(第2组)。耳部的肿胀表示为刺激耳朵与未刺激耳朵的厚度差(cm103,平均数SD)。紫外线组比阳性对照*P0.00001;紫外线组比紫外线+IL-12组*P0.005;紫外线组比阳性对照组*P0.00001;紫外线组比紫外线IL-2组:n.s(无显著性差异)图2 IL-12打破紫外线诱导的WT和Xpa/小鼠免疫耐受C57BL/6(A)或者Xpa/小鼠(B)每日用紫外线照射(分别为1000和400J/m2)背部,时间为4天,在最后一次照射24小时后,致敏紫外线暴露的皮肤区域。首次
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