纤维素酶的检测方法.docx

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1、纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定1 .纤维素CMC酶1.0标题用3. 5 一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。2.0范围生产分析和质量掌握部门适用。3.0原理纤维素CMC酶（EC3. 2.1. 4）水解竣基纤维素分子中B -1. 4葡萄糖昔键,释放出的还原糖（以 葡萄糖计）与3. 5二硝基水杨酸（DNS）反响,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖（以葡萄糖 计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光汲取值查对标准曲线（以 葡萄糖为标准物）可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。4. 0试剂4.1无水醋酸钠（分析纯）4. 2冰醋酸（分析纯）4.

2、3 3. 5一二硝基水杨酸4. 4无水葡萄糖5四水酒石酸钾钠（分析纯）5. 6氢氧化钠（分析纯）7重蒸苯酚（分析纯）6. 8无水亚硫酸钠（分析纯）9叠氮化钠（分析纯）4. 10装甲基纤维素钠5.0仪器5. 1水浴锅（恒温）5015.2电热干燥箱8015. 3 722型分光光度机计4分析天平感量0. 1 mg5.5一级玻璃制品6电冰箱6.0试剂的预备1乙酸一乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成0.1M醋酸钠溶液。溶液B：称取8. 2g醋酸钠，溶解后容至1000ml,制成O.1M醋酸钠溶液。以A： BM： 6的比例混合，低温冷藏备用。6. 2 DNS 试

3、剂:溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中，加入30g分析纯3. 5 一二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g,溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸 钠加入酒石酸钾钠溶液。将A、B溶液混合，定容至5000ml,贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。6.3 CMC溶液：用竣甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。7. 0标准曲线制作：7.1 无水葡萄糖80烘干至恒重。7.2 精确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4冷藏备用。7. 3标准葡萄糖曲线制作IfX lmg/ml 标准葡萄糖液各 0, 0

4、. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 1. 2ml 补加水至 2. 0ml,加入 2. OmlDNS 试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测0D值,3次重 复试验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b 一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。8.0 CMC酶活性测定。8. 1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50PH4. 8条件下，每分钟水解KCMC溶液产生1%还原 糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。8. 2分析程序：取三支15ml刻度试管分别加入0. 2ml稀释酶液，在分别吸取1. 8nlicMC溶液,50水浴保温

5、30分钟，空白样用0. 2ml稀释酶液,加入1. 8ml醋酸缓冲液，同样50水浴30分钟，再吸取DNS2ml 摇匀后，具塞,沸水浴反响10分钟，冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀，用空白调零点，于550nm 下测0D值。9. 0计算活力单位AXDX5X1000CMC 酶活力二Pt/g （ml）30A： 0D值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）I）：酶粉（液）稀释倍数2 . FPA 酶即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素， 释放出的还原糖与3. 5-乙硝基水扬酸（DNS）反响，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原 糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成

6、正比关系。通过在550NM的光汲取值查对标准曲线，可 以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。3 .半纤维素酶：1. 0标题用3. 5 一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位2.0范围生产分析和质量掌握部门适用0原理半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5 一二硝基水杨酸（DNS）反响, 产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的 酶活性成正比。通过在550nm的光汲取值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生 的量，从而确定出酶的活力单位。3. 0单位定义一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（

7、或Ind酶液）于50CPH4.8条件下，每分钟分解现 木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。4. 0试剂无水醋酸钠（分析纯）4.1 冰醋酸（分析纯）3. 5 一二硝基水杨酸（分析纯）4.2 木糖（分析纯）5四水酒石酸钾钠（分析纯）5.6 氢氧化钠（分析纯）重蒸苯酚（分析纯）5. 8无水亚硫酸钠（分析纯）9叠氮化钠（分析纯）6. 10木聚糖（分析纯）0仪器6.1 水浴锅（岳阳家政恒温）501电热干燥箱8016. 3 772型分光光度计6. 4分析天平感量0.16. 5一级玻璃制品6. 6电冰箱7.0试剂的制备：7. 1乙酸一乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：

8、量取冰醋酸6mL定容至1000ml配成0. IMNaNC溶液。溶液B：称取8.2gNaAC,溶解后容至1000mL制成BIMNaAC溶液。使用溶液以A： BM： 6的比例混合，低温冷藏备用。7. 2 DNS试剂溶液A：称分析纯NaoH104g,溶于1300ml水中，加入30g分析纯3. 5一二硝基水杨酸。B：称分 析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸 钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。7. 3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4. 8醋酸缓冲液配成1%溶液。8.0标准曲线制作：8. 1木糖8

9、0烘干至恒重。8. 2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4冷藏备用。8. 3标准木糖曲线制作取 lmg/ml 标准木糖液各 0、 0. 2、 0. 4、 0. 6、 0. 8、 1. 0、 1. 2 补力口水至 2. 0ml,力口入 2. OmlDNS 试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测0D值，3 次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b 一元线性方程，由光密度值引得木糖量。9.0半纤维素酶活性测定；15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2n）l （三支平行样），再各吸取L 8mll%的木聚糖溶液，摇 匀，50水溶60分钟，排毒养颜胶囊取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，马上沸水浴反响 10分钟，冷却后，补加水定容到15ml,轻轻上下摇匀，空白用0. 2nd稀释酶液加。L 8ml醋酸 缓冲液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测0D值。10.0计算活力单位：半纤维素酶活力=稔*口5* 1000） 4-60 u/g（ml）A:0D值在标准曲线上对应的葡萄糖量（mg）D:酶粉（液）稀释倍数