2022年新人教版高中生物选修1《51DNA的粗提取与鉴定》重点高中教案学案一体化 .pdf

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1、课题 1 DNA 的粗提取与鉴定导学诱思 1提取 DNA 的方法提取生物大分子的基本思路是。对于DNA 的粗提取而言，就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1）DNA 的溶解性DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。图 51 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考：在什么浓度下，DNA 的溶解度最小？DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度是如何变化的？如何通过控制NaCl 溶液的浓度使DNA 在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于溶液，但是细

2、胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将 DNA 与蛋白质进一步的分离。2）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解，但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080oC 的高温，而DNA 在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解，但对DNA 没有影响。3）DNA 的鉴定在条件下，DNA 遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。2实验设计1）实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌思考：哺乳动物的红

3、细胞的特点？2）破碎细胞，获取含DNA 的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。思考：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？3）去除滤液中的杂质阅读课本的三个方案，思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方案二与方案三的原理有什么不同？4）DNA 的析出与鉴定将处理后的

4、溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支 20ml 的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl 溶液 5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml 的。混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA 的溶液是否变。3操作提示以血液为实验材料时，每100ml 血液中需要加入3g，防止。加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免，导致DNA 分子不

5、能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。4结果分析与评价疑难点拨 1 DNA 的溶解度与NaCl 溶液浓度的关系：当 NaCl 溶液浓度低于0.14mol/L 时，随浓度的升高，DNA 的溶解度降低；当NaCl 溶液浓度高于0.14mol/L 时，随浓度升高，DNA 的溶解度升高。2 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA 主要存在于细胞核中，所以在离心

6、或静置沉淀后，要弃出上层清液血浆。3提取 DNA 的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA 含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA 的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA 全部溶解；第三步是DNA 的纯化，即根据 DNA 的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA 与杂质分开；最后一步是对DNA 进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。4在 DNA 的析出的步骤中用到玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。5盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容

7、器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA 的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的 DNA 就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的 DNA 的损失。典例解析 本实验中有三次过滤：过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y

8、1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T

9、6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y

10、1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T

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12、1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T

13、6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl 溶液过滤溶解有DNA 的 2

14、mol/LNaCl 溶液以上三次过滤分别为了获得（）A 含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA 的滤液B 含核物质的滤液、滤液中DNA 粘稠物、含DNA 的滤液C 含核物质的滤液、滤液中DNA 粘稠物、纱布上的DNA D 含较纯的DNA 滤液、纱布上的粘稠物、含DNA 的滤液答案：A 解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA 和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA 在 0.13mol/LNaCl 溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。【课本问题答案和提示】（一）旁栏

15、思考题1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA 的溶解。3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA 释放不完全，提取的DNA 量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖

16、和RNA 等杂质。5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA 溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA 分离。（二）练习1答：提取 DNA 的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA 含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步

17、是DNA 的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA 全部溶解；第三步是DNA 的纯化，即根据DNA 的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA 与杂质分开；最后一步是对DNA 进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。2答：提取蛋白质比提取DNA 的难度大。这是因为，与DNA 相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH 等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO

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19、3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO

20、8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W

21、3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO

22、8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W

23、3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO

24、8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。课堂演练 一、选择题（10 个）1.在研究DNA 的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是（D）A.除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C.除去血细胞表面的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA 释放，便于进一步提纯2与析出DNA 粘稠物有关的叙述，不正确的是（C）A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA 的溶解度B.在操作 A 时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA

25、 分子完整C.加蒸馏水可同时降低DNA 和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl 的浓度相当于0.14mol/L 3洗涤剂能够瓦解（B），但对DNA 没有影响。A.细胞壁B.细胞膜C.细胞核D.细胞质4在沸水浴的条件下，DNA 遇（D）会被染成蓝色。A.斐林试剂B.苏丹染液C.双缩脲试剂D.二苯胺5在 DNA 提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（B）A.不易破碎B.减少提取过程中DNA 的损失C.增加 DNA 的含量D.容易洗刷6下列操作中，对DNA 的提取量影响最小的是（B）A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA 等核物质B.搅拌时，要使用玻璃棒沿

26、一个方向轻缓搅拌C.在“析出DNA 粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E 在 DNA 的溶解和再溶解时，要充分搅拌7DNA 的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（D），静置2 3min，溶液中会出现白色丝状物。A.09%的 NaCl B.0.14mol/L 的 NaCl 溶液C.质量分数15%的 HCl D.体积分数为95%的酒精溶液8.以血液为实验材料时，需要向血液中加入（C），防止血液凝固。A.醋酸钠B.龙胆紫C.柠檬酸钠D.醋酸洋红9.在向溶解DNA 的 NaCl 溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（C

27、）A.加快溶解DNA 的速度B.加快溶解杂质的速度C.减少 DNA 的溶解度，加快 DNA 析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（C）分解蛋白质。A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.肠肽酶二、非选择题（3 个）1提取鸡血中DNA 时，要除去血液中的上清液，这是因为什么？答案：因为上清液是血浆，不含有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。2填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。提取鸡血细胞中核物质溶解核内DNA：文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9

28、D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码

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32、D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码

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34、D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6析出 2mol/LNaCl 溶液中的DNA DNA 粘稠物的再溶解提取杂质较少的DNA 白色乳状丝状物DNA 的鉴定答案：蒸馏水2mol/LNaCl溶液蒸馏水2mol/LNaCl溶液冷却的95%的酒精二苯胺3.关于 DNA 粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中细胞树木较多，可以提供丰

35、富的。实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是。生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是因为。若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最好增加程序，使组织细胞更易分离。答案：含细胞核；红；DNA 鸡血细胞液中DNA相对含量很难提取到DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核研磨【知识拓展】1.二苯胺鉴定DNA 的化学原理DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液

36、中DNA 含量的多少有关。2.研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA 在这一体系中呈稳定态（Tris 为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是 DNA 酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA 酶降解 DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA 分离。【教学反思】文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U

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40、码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U9D2W3 ZV4B4Y1V1Y6文档编码:CO8M6G9R2T6 HF6S6U

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