中国鲁法海绵葫芦上果疽和硅藻致炭疽病的鉴定与表征.docx

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1、中国鲁法海绵葫芦上果发用硅藻致炭疽病的鉴定与表征抽象Luffa海绵葫芦(Luffa cylindrica)是一种重要的葫芦科蔬菜，被称为丝瓜的来源。从2020年到2021年，中国湖南省路法叶上 发生了叶病。病症表现为椭圆形至不规那么的绿化病变，周围有黄色晕。从受影响的叶子中别离出病原体。根据对内转录间隔体 (ITS)、肌动蛋白(4CT)、甲壳素合酶(CHS-7)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、B微管蛋白(TUB2)和局部交配型 (Mat1-2)基因Fp做仃)区域的形态学表征和分子鉴定，将病原菌鉴定为果柴糖胶和C两种。s/amecse科赫的假设通过致 病性测试和重新确认来识别。据我们所知

2、，C. fruchco/a和C. siamense是与luffa海绵葫芦炭疽相关的两个新物种。关犍字:形态学表征;多位点系统发育分析;“佑cylindncai;Colletotrichum siamense1.引言Luffa cylindrica (L.) Roem (Luffa sponge gourd),属于葫芦科，是一种重要的园艺作物。这种植物在全球热带和亚 热带地区广泛种植，包括亚洲，美洲和非洲国家1。海绵葫芦是一种商业作物，因为它具有重要的蔬菜和药用价值2, 3o近年 来，路法海绵葫芦种植取得了良好的经济效益，种植面积不断扩大。然而，在路法海绵葫芦中已经记录了许多疾病。例如，由 小省

3、子虫做单稔子虫引起的葫芦霜霉病4, 5,由灰廖躬I起的灰霉病6, 7, 0尖抱镰刀菌引起的枯萎镰刀菌。2a属领,由 Sclerotium rolfsii 引起的茎腐病9,由 Phytophthora capsica 弓I起的 Phytophthora 果实腐烂10和由 Stagonosporopsis cucu力ceawm引起的水果腐烂11。此外，炭疽病是溺声挣作物的常见病害12。据记录,倒物坳是倒在乳杆菌的病原体13。 然而，到目前为止，还没有关于其他C。/。加物种引起luffa炭疽病的报道。2020年8月和2021年8月，我们观察到中国湖南省一些私人养殖场海绵葫芦上叶斑病的发生。几乎90%

4、的被调查叶子 被感染。病症主要发生在海绵葫芦的叶片，包括浸水、圆形、淡黄色、绿斑，以及延伸或合并为椭圆形或不规那么的病斑。斑点 的边缘是棕色的，中心是灰白色的，外面有明显的黄色光晕。当它干燥时，斑点的中心很容易穿孔和破裂(图1) o在后期阶段, 病斑进一步扩大，导致叶枯病和枯萎。在这项研究中，负责该疾病的病原体是通过检查其形态学和分子特征，并通过致病性测 试来实现Koch的假设来确定的。Figure 1. Symptoms of the diseased luffa sponge gourd leaves in field.2.结果真菌别离从湖南省长沙市10个养殖场采集的10个受感染海绵葫芦叶

5、片中共获得10株真菌别离株。别离株的信息如表1所示。根 据菌落形态，真菌菌株主要被鉴定为CO/E。打物种。选择4种别离株，推测可分为两类，用于进一步的形态学和分子鉴 定。表1.从路法海绵葫芦中别离出的信息。22形态学表征当在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养时，CSSGY1, CSSGY5-1和CSSGY5-2是白色的，逐渐变成灰白色，含 有密集的空中菌丝体（图2A, B） o对于CSSGY1, CSSGY5-1和CSSGY5-2菌株，分生的子为透明，单细胞，无倍体，长 椭圆形至圆柱形，测量。Appressoria是棕色的，几乎是椭圆形或不规那么的，测量值为 对于菌株CSSGY4,菌落为灰

6、绿色至棕色。分生抱子为透明，单细胞和长圆柱形，平均尺寸为 。Appressoria 为棕色至深黑色，卵形至略微不规那么，6.12-10.20x4.08-8.16|jm （图 2C, D）。四 种菌株的分生泡子和附子的特征描述在表2中。形态学特征和系统发育分析的结合证实，CSSGY1、CSSGY5-1和CSSGY5-2 菌株属于 C. siamense,而 CSSGY4 属于 C. fructicolaoCSSGY4CSSGY4CSSGY1CSSGY5-1CSSGY5-2图2.从路法海绵葫芦中别离出的菌落、分生抱不附睾的形态学特征。(A)在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养的真菌菌株CSSGY4,

7、 CSSGY1, CSSGY5-1和CSSGY5-2的阳性侧的菌落形态。(B) PDA上的反面。(C)分生抱子的显微镜检查。(D)验尸。比例尺=100 pm。表2,从路法海绵葫芦中别离出的次为um菌株的形态学特征。分子鉴定为了进行分子验证，扩增并测序了 CSSGY1, CSSGY4, CSSGY5-7初CSSGV5-2四种代表性菌株的内部转录间隔物 (ITS),肌动蛋白( ACT),甲壳素合酶(CHS-1),甘油3磷酸脱氢酶(GAPDH),即微管蛋白2 (TUB2)和局部交配型 (Mat1-2)基因(以丁)序列。所有获得的序列都存放在GenBank中，加入号列于表3中。BLASTn检索显示，C

8、SSGY1 CSSGY4, CSSGY5-1 和 CSSGY5-2 的 ITS 与 C. gloeosporioides 别离株的 ITS 相同，而 CSSGY1. CSSGY5-1 和 CSSGY5-2 的 GAPDH、ACT. CHS-1、7U82和丁序歹ij与 C. s/ameose 菌株最相似，其身份范围为 97.94%100%。对于 CSSGY4,GAPDH, ACT, CHS-1, 7UB2和 4pA/M丁序歹U与相应的果树C.表3.关于用于系统发育分析的物种的GenBank加入数量的信息。为了进一步进行系统发育分析，构建了基于ITS、ACT. CHS-1、GAPDH、九旧2和Ap

9、M/47串联数据集的相邻连接系统 发育树，其中包括4个菌株和10个参考的Colletotrichum菌株。系统发育分析显示，菌株CSSGY1、CSSGY5-1和CSSGY5-2 与C.s/amecse分支聚集在一起，包括类型菌株CBS： 125378,而菌株CSSGY4与柒倒干衣原体分支分组，这与使用BLASTn 进行的同源性搜索结果一致(图3)。70i CSSGY186ColMotrichum si9mense culture CBS：1253789gl CSSGY51 Fl. CSSGY5-2 ColMotrichum smcnso culturo ICMP：18578IColMotric

10、hum alnum culture ICMP:18691I Coltetotrichum alienum culture ICMP:12071Coletofrichum fructkolti culture CBS：238.49bj CSSGY4| L- ColMotfichum /rucf/co/a culture ICMP:1872789| f- Cotletolrichum fructicotaculture ICMP:1&581TH Ccllctotrichum fructiCQfa culture CBS:125397p- ColMotrichum nupharicofa cultu

11、re CBS:47Z961001. CoHetofrichum nupharkofa culture CBS:469.96图3.使用邻接方法，基于内部转录间隔蛋白(ITS),肌动蛋白(ACT)，甲壳素合酶(CHS 7),廿油醛3磷酸脱氢酶(G4P0H), B-微管蛋白(TUB2)和局部交配型(Mat1-2)基因(ApMAT)区域的串联序列构建系统发育树。分支中的注释指示支持从1000 个重复的引导测试中计算的分支的引导值。别离物CSSGY1, CSSGY4, CSSGY5-1和CSSGY5-2用红点标记。比例尺指示 每个位置的替换次数。用于系统发育分析的Co/dof次为um物种的序列信息如表3

12、所示。24致病性检验选择四种代表性别离株进行致病性试验。Luffa盆栽海绵葫芦植物在体内接种分生泡子悬浮液。接种5天后，所有接种的 海绵葫芦叶均出现病症，接种部位出现黄色光晕。后来，出现了叶斑，这些斑块扩大了，并且在某些情况下被穿孔，这与在田 间观察到的相似。在对照植物上没有观察到病症(图4) o所有四种菌株都对路法海绵葫芦植物具有致病性，并引起类似的病症。从接种的有病症叶片中回收致病真菌，并使用上述方法通过形态学观察和分子测序进行鉴定，从而实现了 Koch的假设。ControlControlInoculatedInoculated图4.菌株CSSGY1, CSSGY4, CSSGY5-1和C

13、SSGY5-2在路法海绵葫芦上的致病性测试。(A-D)人工接种有(A) CSSGY1, (B) CSSGY4, (C) CSSGY5-1和(D) CSSGY5-2的。/E。七人加7别离株的盆栽海绵葫芦植物的病症。左边和右边的植 物分别表示对照和接种的植物。接种5天后，所有接种的海绵葫芦叶均出现病症。对照植物上没有明显的病症。3 .讨论和结论本研究通过培养和显微镜检查别离并鉴定了叶斑感染的路法海绵葫芦的真菌病原体;使用ITS, ACT, CHS1 GAPDH, TUB2和ApA447的串联数据集进行系统发育分析;对盆栽路法海绵葫芦进行致病性试验。病原体被证实是两种Colletotrichum物

14、种：C. siamense fn C. fructicolao因此，卢法海绵葫芦中的这种疾病被鉴定为炭疽病。据我们所知，这是C. siamense fn C. ucf/co/a在luffa海绵葫芦中引起炭疽病的第一次报道。这种新病及其致病因子的鉴定为路法海绵葫芦疾病的诊断和控制提供了 重要依据。Colletotrichum物种是一种真菌群，在广泛的植物宿主中引起疾病。Colletotrichum属中的一些物种很难使用单一形态学 观察和单基因位点分析来区分;因此，多基因系统发育分析被认为是鉴定单个别离株所必需的14。在我们的研窕 中，基于串联的ITS, ACT, CHS-1, GAPDH,九旧2

15、和ApMA丁六基因系统发育分析，将4种对路法海绵葫芦致病的代表性 别离株分为两型：C. siamense C. fructicola.这是这些物种首次被记录为引起luffa炭疽病的病原体，这是拓宽我们对两种 Coletotrichum物种引起的各种植物病害的理解的另一个方面。C. ucf/co/a是从C. g/oeospo/7o/des物种复合体建立的物种。它在全球分布，宿主范围广泛，包括一些重要的水果作物, 如苹果，梨，辣椒和草莓，以及其他经济作物和蔬菜，如油茶15,茶16和辣椒17。果照蛆引起的特别令人担忧的疾病是苹 果的型次芽例十斑病，这可能导致受感染植物严重落叶18, 19。C. s/

16、amecse也存在于C.gQeospo3des物种复合体中，该 复合物首先记录在咖叩浆果上20。据报道，C.s/amecse是炭疽病的全球病原体，存在于多种具有重要经济意义的植物上，包 括水果、观赏植物和蔬菜，如芒果、奶油苹果、木瓜、茶树、辣椒、柿子、橙子、鳄梨、番石榴、橡胶植物和茉莉21, 22, 23, 24, 25, 26o到目前为止，关于葫芦类蔬菜中由柒蝇蛆和暹罗7单胞菌引起的疾病的报道很少报道。炭疽病会损害叶子，经常导致枯萎和落叶。因此，它可能严重影响植物的光合作用，进而影响路法海绵葫芦果实的产量。 由于C. siamense和C. fructicola也具有相对广泛的宿主范围，因此

17、luffa海绵葫芦的病原体也可能感染附近种植的其他蔬菜。 在这项研究中，卢法海绵葫芦的炭疽病发生在近90%的植物中。因此，为进一步减轻这种疾病可能造成的损害，应开展全球 预防和管理战略研究。考虑到食品和环境平安，抗性育种可能是控制这种疾病的理想方法。此外，分子检测方法的开展对于疾 病的早期诊断和预防也很重要。最后，鉴定并表征了卢法海绵葫芦上新出现的炭疽病的致病菌。通过形态学特征和多基因测序和系统发育分析对真菌别离 株进行别离鉴定。测试代表性别离株的致病性。这些病原体的鉴定可能为路法海绵葫芦疾病的诊断和管理提供重要的见解。4 .材料和方法样本收集和真菌别离2020年8月至9月和2021年，从中国

18、湖南省长沙市的不同菜园中采集了具有可见叶斑的路法海绵葫芦叶。观察并记录 患病叶片的病症。将约5x5毫米碎片中的小切片从病变的连接处切断，用70%酒精消毒30 s, 0.1%氯化汞45 s,用无菌蒸储 水冲洗3次，然后置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上并在黑暗中在28。（3下培养。从样品片段中别离出的Hyphal吸头被 拾取并转移到新鲜的PDA板上并在28下孵育。进行单胞子别离以纯化真菌培养物。将所有单抱子培养物在4下储存在 冰箱中。形态学和文化特征对于形态学检查，将真菌菌株的菌丝塞（8mm直径）接种在PDA上并在28。下培养。7 d后，观察菌落的形态和颜色 特征。使用光学显微镜（生命技术，

19、EVOS） XL核心成像系统在400x放大镜下观察分生胞子和附生他子的形态。通过测量 约50个随机选择的结构来确定分生抱子和附生抱子的长度和宽度。分子鉴定如前所述，使用CTAB方法从菌丝体中提取基因组DNAR7,并用作PCR扩增的模板。ITS、ACT. CHS-1、GAPDH、 九旧2 和 Ap/V/A7基因区分别使用引物 ITS4/ITS5 27, 28、ACT512F/ACT783R 23, CHS-79F/CHS-345R 29. GDF/GDR 30 T1/Bt2b 15和AMF1/AMR1 31进行扩增。聚合酶链反响（PCR）在25PL反响系统中进行,包括L基因组DNA, 12.5p

20、LPCR预混液，1pL （10mM）每个引物和9.5pL无菌蒸储ddH2o.PCR程序包括在95下初始变性4分钟，然后34 次循环，95。（3循环30 s （变性），56至60。循环30 s （退火），72。下45 s （延伸），最后延伸72P5分钟。使用1%琼 脂糖凝胶电泳获得PCR产物。PCR产物由上海二刚公司（中国）采用双脱氧终止法进行测序。所有获得的ITS, ACT, CHS-1, GAPDH, TU82和Ap/VMT序列均被提交到GenBank数据库，并通过BLASTn与国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行 比拟32。选择我们的别离株和其他类似Co/eto/c/?um物种的IT

21、S, ACT, CHS-1, GAPDH, TU82和Ap/IMT序列进行系统发育分析。ITS、ACT. CHS-1、GAPDH、TU82和7位点的串联序列与ClustalX对齐33,并在MEGA 6中使用NJ方法进 行系统发育树构建，通过1000次复制计算自举值34。致病性测定为了实现Koch的假设，通过在具有分生抱子悬浮液的盆栽海绵葫芦植物中进行体内接种来对代表性菌株进行致病性测试。 将4个菌株在28P的PD液体培养基上在振荡器培养箱(180rpm/min)中培养4天，用4层无菌纱布过滤以收获分生抱子悬 浮液，然后将其调节至最终浓度为1x105通过血细胞计数器检测抱子/mL。用70%酒精消

22、毒路法海绵葫芦植物的叶子。通过在 每个植物上喷洒5 mL分生胞子悬浮液进行接种，同时使用相同的程序在对照植物上接种无菌水。将所有接种的植物置于26C 下相对湿度为95%的塑料室中，光/暗循环16/8 h。每天观察所有接种物的病症进展。实验重复两次，每个菌株接种三种盆栽植 物。为了证实Koch的假设，从实验性有病症的叶子中重新别离病原体真菌菌株，并根据上述形态学和分子特征进行鉴定。资料分析统计分析是使用社会科学统计软件包(SPSS) (Windows版本22.0,旧M公司，Armonk,纽约，美国)进行的。对分 生施子和附生胞子的长度和宽度进行方差分析(ANOVA)。使用显著性最小差异检验在显著性水平0.05时比拟均值。