最新实时定量PCR Real-time quantitative PCRPPT课件.ppt
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1、实时定量实时定量PCR Real-time PCR Real-time quantitative PCRquantitative PCRReal time PCR的应用mRNA表达的研究表达的研究微小残留病变的检测微小残留病变的检测肿瘤耐药基因表达的研究肿瘤耐药基因表达的研究病毒感染的定量监测病毒感染的定量监测 回顾:回顾:PCR基本原理基本原理PCR是在试管中进行是在试管中进行DNA复制反应,基本原理与复制反应,基本原理与体内相似体内相似 在模板、引物、在模板、引物、4种种dNTP和耐热和耐热DNA聚合酶等存聚合酶等存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的在的条件下,特异扩增位于两段已知
2、序列之间的DNA区段的酶促合成反应。区段的酶促合成反应。基本步骤基本步骤变性:加热使双链变性:加热使双链DNA变为单链变为单链退火:降温使引物和互补模板在局部形成杂交链退火:降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸:耐热延伸:耐热DNA聚合酶按聚合酶按53方向催化以引物方向催化以引物为起始点的延伸反应为起始点的延伸反应示意图Real-timeReal-time定量定量PCRPCR仪是仪是在在PCR反应体系中反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。知模板进行定
3、量分析的方法。在在real-timeQ-PCR中,对整个中,对整个PCR反应扩增过程进反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,为了便于对所检测样本进行不能与背景明显地区别,为了便于对所检测样本进行比较,在比较,在real-timeQ-PCR反应的指数期,首先需设反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值定一定荧光信
4、号的域值,一般这个域值(threshold)是是以以PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是号,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号个循环的荧光信号的标准偏差的的标准偏差的10倍。倍。Linear 20 to 1500Linear 20 to 1500 检测检测PCR产物产物的量是在的量是在PCR反应处于指数期的某一点反应处于指数期的某一点上,并且由此来推断模板最初的含量。上,并且由此来推断模板最初的含量。样本的域值循环数(样本的域值循环数(Ct)的含义是:每)的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值个反应管内的
5、荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。时所经历的循环数。Ct thresholdthreshold域值循环数(域值循环数(Ct)的含义:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值)的含义:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值(threshold)时所经历的循环数。时所经历的循环数。研究表明,每个模板的研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从
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