病毒的分类及微生物检验.ppt

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1、病毒的分类及微生物检验 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望二、病毒分类系统和命名二、病毒分类系统和命名（一）病毒分类一般系统病毒分类系统将病毒分类为科(families)、属(genera)、种(species)等三级，或科、亚科、属、种等四级。根据病毒体的形态、基因结构和复制模式等特征将病毒分为科和亚科；在科或亚科中又根据理化特性和血清学特性等分病毒属，属名后缀为virus，属下分为不同的病毒种。分类分类可将病毒分为科、亚科和属可将病毒分为科、亚科和

2、属常用核酸类型分类常用核酸类型分类1DNAvirus(DNA病毒中有病毒中有9科科)2RNAvirus(ssRNA7科科.ssRNA7科科.dsRNA2科科)3反转录病毒反转录病毒(DNA和和RNA反转录病毒中有反转录病毒中有2科科)依传播方式和感染部位分类依传播方式和感染部位分类1虫媒病毒虫媒病毒2肠道病毒肠道病毒3呼吸道病毒呼吸道病毒4肝炎病毒肝炎病毒5性传播病毒性传播病毒（二）非寻常病毒的分类（二）非寻常病毒的分类1卫星病毒（卫星病毒（satellites）2类病毒（类病毒（viroids）3朊粒（朊粒（prion）第三节第三节病毒学诊断病毒学诊断自身免疫病和肿瘤密切相关。病毒性疾病在人

3、类疾病中占有十分重要的地位。由于病毒感染的防治原则不同于细菌等其他微生物，尽早判定病人感染或某传染病的流行是由病毒所致，是医生和微生物学实验室的责任和任务。病毒的分离与鉴定当然是病毒病原学诊断的金标准，但因病毒是严格细胞内寄生，病毒分离必须有活的细胞支持，故病毒的分离鉴定较困难。一、标本的采集、运送和处理一、标本的采集、运送和处理1.应在感染早期（发病12天内）采集。2.必须无菌操作，对用于病毒分离培养的污染标本用高浓度抗生素处理过夜，必要时需加抗真菌药物等3.及时送检，送检的组织等可放入含有抗生素的50%甘油缓冲盐水或二甲基亚砜中低温冷藏。4.血清学检查的标本，尤其检测抗病原体的IgG型抗体

4、，应分别在发病初期和恢复期采集双份血清，只有当恢复期血清抗体效价比初期升高4倍或以上，才具有确诊意义。分离培养鉴定分离培养鉴定(污染标本用抗生素处理过夜污染标本用抗生素处理过夜)快速诊断快速诊断鸡胚鸡胚红红细细胞胞凝凝集试验集试验红红细细胞胞凝凝集集抑抑制制试试验验细胞培养细胞培养CPECPE电镜检测电镜检测中和试验中和试验TCID50TCID50pfupfu测定测定MOIMOI测定测定动物接种动物接种观观 察察 发发 病病情况情况中和试验中和试验免免 疫疫 学学 检检测测ID50ID50测定测定LD50LD50测定测定形态学形态学电镜观察电镜观察病毒颗粒病毒颗粒（大小、（大小、形态）形态）光

5、学显微镜光学显微镜观察观察包涵体包涵体抗原抗原检测检测ELISAELISAIFIFRIARIAWBWB核酸检测核酸检测核酸电泳核酸电泳核酸杂交核酸杂交PCRPCR基因芯片基因芯片基因测序基因测序抗体抗体检测检测ELISAELISARIARIAIFIFWBWB病毒成分检测病毒成分检测 标本采集标本采集 二、病毒的分离与鉴定以下情况需考虑进行病毒分离与鉴定：1.病程长且诊断困难的病人。2.怀疑为新现病毒（emergent virus）感染或已被消灭的病毒性疾病怀疑“死灰复燃”。3.为鉴别临床上具有相同症状的疾病。4.监测所用减毒活疫苗。5.用于病毒生物学性状的研究或流行病学调查等。（一）病毒的分离

6、培养1细胞培养：细胞培养：原代培养细胞、二倍体细胞株、传代细胞系或株标本接种后溶细胞型感染病毒可致细胞出现细胞病毒效应（CPE），稳定感染病毒细胞并不出现明显病变，但被感染的细胞膜表面会表达病毒蛋白等标志物，如血凝素、神经氨酸酶、病毒特异性抗原等。2鸡胚培养和动物接种鸡胚培养和动物接种：流感病毒的分离培养虽可用犬肾传代细胞（MDCK）,但鸡胚接种仍是最常用的敏感而特异的方法。动物接种是最原始的分离病毒的方法，但目前少用。（二）病毒的鉴定（二）病毒的鉴定1病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标（1）细胞病变（）细胞病变（cytopathiceffect,CPE）大多数病毒属

7、溶细胞型感染，在敏感细胞内增殖会出现CPE。CPE表现为细胞内颗粒增多、圆缩、聚集、融合，有的可形成包涵体，出现细胞溶解、脱落、死亡等。不同病毒的CPE特征不同。因此，观察病毒所致CPE的特点，根据细胞类型，细胞病变种类可对标本中感染的病毒进行判定。脊髓灰质炎病毒感染所致CPEa.未感染的vero细胞（一种非洲绿猴肾细胞系）b.脊髓灰质炎病毒感染的vero细胞（显示细胞圆缩、分散、坏死、脱落）。（2）红细胞吸附（）红细胞吸附（hemadsorption）包膜上带有血凝素的病毒感染敏感细胞后，血凝素会出现于细胞膜表面，使感染细胞能与加入的红细胞结合出现红细胞吸附现象，这是检测正粘病毒和副粘病毒的

8、间接指标。（3）中和试验（）中和试验（neutralizationtest,NT）用抗某病毒血清先与待测病毒悬液混合，经作用一定时间后接种敏感细胞，培养后观察CPE或红细胞吸附现是否消失，即特异性抗体是否能中和相应病毒的感染。如用不同浓度的抗血清进行中和试验，还可根据抗体的效价对待测病毒液进行半定量检测。（1）空斑形成试验（）空斑形成试验（plaqueformation）（2）50%组织细胞感染量组织细胞感染量（3 3）感染复数）感染复数 （Multiplicity of infection,MOIMultiplicity of infection,MOI）2病毒感染性测定及病毒数量测定病毒感

9、染性测定及病毒数量测定 三、病毒感染的快速诊断三、病毒感染的快速诊断病毒的分离与鉴定是病毒诊断的金标准，但临床实验室应用困难，而且费时，对临床病毒感染症的诊治帮助不大。快速诊断主要指临床标本绕过分离培养复杂而较长的过程，直接在电镜下观察病毒颗粒，或直接检测标本中的病毒成分和IgM抗体等，以作出快速和早期诊断。（一）形态学检查（一）形态学检查1电镜和免疫电镜检查电镜和免疫电镜检查含有高浓度病毒颗粒（107颗粒/ml）的样品，可直接应用电镜技术观察。对含低浓度病毒的样本可用免疫电镜技术，或用超速离心机将标本离心进行电镜观察，以提高检出率和特异性。电镜下不仅能观察病毒的形态学特征，还可测量病毒的大小

10、。2光学显微镜检查光学显微镜检查病理标本或含有脱落细胞及针吸细胞的标本检测病毒包涵体。包涵体对病毒的诊断有一定价值。观察病毒CPE。病理标本根据病理特征，再配合组化染色技术进行诊断。（二）病毒蛋白抗原检测（二）病毒蛋白抗原检测1.酶联免疫技术酶联免疫技术（ELISA）2.免疫荧光标记技术免疫荧光标记技术（IF）3.放射免疫标记放射免疫标记（SPRIA）这些技术操作简便、特异性强、敏感性高。尤其使用单克隆抗体标记技术可测到ng（10-9g）至pg（10-12g）水平的抗原或半抗原。其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐渐被非放射性标记物（如地高辛等）所代替。（三）早期抗体检测（三）早期抗体检测

11、1IgM型特异抗体检测检测病毒感染机体产生的特异性IgM，如孕妇羊水中查到IgM型特异抗体可早期诊断某些病毒引起的胎儿先天性感染；IgM抗体测定有助于早期诊断，但感染机体产生IgM抗体有明显个体差异。2免疫印迹试验（Westernblot,WB）某些病毒感染的诊断需持慎重认真的作法。如AIDS和成人白血病等，在初筛试验阳性后，尚需用WB法进行确认试验。（四）检测病毒核酸（四）检测病毒核酸1核酸电泳：正粘病毒属和呼肠病毒属的核酸是分节段的，甲型流感病毒8个节段，轮状病毒11个节段。从标本中直接提取轮状病毒的核酸，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和银染色后在凝胶板上清楚核酸条带，结合临床情况可进行诊断。2核酸杂交：其原理是应用已知序列的核酸单链作为探针（probe），探针预先用放射性核素（32P或131I）或生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等标记，在一定条件下按碱基互补规律与标本（1）斑点杂交（dotblothybridization）：（2）原位杂交（insitehybridization）：（3）DNA印迹（southernblot）和RNA印迹（northernblot）杂交技术3聚合酶链反应（PCR）4基因芯片技术（genechip）5基因测序包括病毒全基因测序和特征性基因片段的测序。