目的基因的制备-基因文库法.ppt

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1、目的基因的制备-基因文库法 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望目的基因的获取目的基因的获取/制备制备人工合成cDNA文库基因组文库聚合酶链式反应1.基基因因文文库库2.cDNA文文库库3.人人工工合合成成4.PCR2/46基因组文库基因组文库(genomic library)(genomic library)3/46分离基因组分离基因组DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入细胞导入细胞筛选筛选限制性内切酶限制性内切酶基因组基因组DNADNA基因重

2、组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装4/46 以以 l l 噬菌体制作基因噬菌体制作基因 组文库组文库,在一个基因组文库面在一个基因组文库面，所有可能的所有可能的 基因皆被大量复制基因皆被大量复制。利用探针筛选特定基因利用探针筛选特定基因。5/46组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组文库基因组文库 存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由克隆载体所携

3、带的所有基克隆载体所携带的所有基因组因组DNA片段的集合片段的集合.从基因组文库获取目的基因从基因组文库获取目的基因 每个细胞含有一个基因组每个细胞含有一个基因组DNA片段与载体的重组片段与载体的重组DNA分分子，许多细胞组成一个含有基子，许多细胞组成一个含有基因组各因组各DNA片段克隆的集合体片段克隆的集合体.genomic library6/46 基因库是通过重组技术转化筛选而建立，基因库是通过重组技术转化筛选而建立，利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快、繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体，繁殖能力强的特点作为一种核酸扩增的载体，把人类等高

4、等生物的基因或其片段重组其中，把人类等高等生物的基因或其片段重组其中，成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因成为便于保存、取用方便的基因库。建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。纯化。7/46基因组文库的质量评价和完备性基因组文库的质量评价和完备性 基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组基因组文库必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出中的任何序列。基因组文库完备性是指从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。含有某一目的基因的重组克隆的概率。如果满足两个条件

5、：生物体染色体如果满足两个条件：生物体染色体DNA片段被全部克隆，片段被全部克隆，用于构建基因文库的用于构建基因文库的DNA片段含有完整的基因，则此基因文片段含有完整的基因，则此基因文库的完备性就是库的完备性就是1。用基因组文库的克隆数表示基因组文库的大小即用基因组文库的克隆数表示基因组文库的大小即库容量库容量。8/461.理论值理论值基因组文库的克隆数目（N）基因组DNA总长DNA插入片段的平均长度 某种生物基因组DNA总长度为3106 kb，酶切后的DNA片段平均长度为15 kb，则基因组文库的克隆数应为 3106 kb/15 kb=2105个克隆。在实际工作中，由于在基因组文库的构建过程

6、中存在多步操作，一个具备完好代表性的基因组文库的库容量大大超过这个理论值。9/462.经验值经验值 ln(1f/g)N=ln(1P)P为从文库中选出任一基因或DNA序列的概率即完备性，一般 设为99（0.99）；f为载体容量（kb）；g为基因组大小（kb）；N为基因组文库的克隆总数，表示文库中以P概率出现某段DNA,理论上应具有的最少克隆数；10/46人单倍体DNA总长为3109bp 若载体装载量为15kb则构建完备性为 0.9 的基因组文库大约需要 个重组克隆.完备性完备性0.990.9990.999946万库容量库容量92万138万184万?11/46表表 几种典型生物基因组文库大小与载体

7、容量的关系几种典型生物基因组文库大小与载体容量的关系种类基因组（bp）10kb（质粒）25kb（噬菌体）45kb（粘粒）理论值经验值理论值经验值理论值经验值大肠杆菌4.61064602116184845102468酿酒酵母1.81071800828772033134001840水稻5.710857000262492228001049961266758330人3.210932000014736521280005894597111132747612/46选择载体的主要参数是基因组大小选择载体的主要参数是基因组大小构建大肠杆菌（4.6106bp）等基因组较小生物的基因组文库时，按每个DNA片段平均长

8、5kb计算，一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列，采用质粒作为载体便可得到满意的结果。构建较大基因组的文库时，噬菌体、粘粒及YAC常选作克隆载体。基因组文库分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）。13/46可获得的基因可获得的基因HGP对比分析内含子、外显子及调控区域对比分析内含子、外显子及调控区域基因原始结构功能的研究基因原始结构功能的研究应用范围应用范围该种生物所有基因该种生物所有基因14/46cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)15/46逆转录

9、mRNADNA以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。16/46逆转录病毒细胞内的逆转录现象：逆转录病毒细胞内的逆转录现象：RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNARNA酶酶单链单链DNA双链双链DNA 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNA同样具同样具有遗传物质的传代与表达功能。有遗传物质的传代与表达功能。17/46逆转录酶的应用逆转录酶的应用:应用于基因工程应用于基因工程基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链18/46尿素-氯化锂法硫氰酸胍法polyT亲和层析法密度梯度离心分级法探针筛选法mRNA的提取与纯化19/4

10、6polyTpolyT亲和层析法亲和层析法AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApolyTpolyTpolyTpolyTpolyTpolyT20/46基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA cDNA cDNA文库的组建文库的组建1.mRNA提取 2.cDNA合成 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成3.双链cDNA的分子克隆4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖.21/46mRNA分离纯化分离纯化反转录合成反转录合成cDNA构建构建cDNA文库文库筛选目的基因筛选目的基因22/46反转录合成单链反转录合成单链cDNA 23/46置换合成法合成置换合成法

11、合成cDNA第二链第二链 24/46引物引物-衔接头法合成衔接头法合成cDNA第二链第二链 25/46 包含着细胞全部包含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克隆集合克隆集合称该组织细胞的称该组织细胞的cDNA文库文库.基因组基因在特定的组织细胞中只有一部分基因组基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，且在不同条件、不同分化时期的细胞其基表达，且在不同条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，因表达的种类和强度也不尽相同，cDNA文库具有文库具有组织细胞特异性。组织细胞特异性。26/46cDNA文库的质量评价 高丰度mRNA的cDNA 克隆所占的比例高，分离容易，低丰度mRNA

12、的cDNA克隆所占的比例低，分离困难。mRNA根据其在细胞中的拷贝数即丰度低丰度：拷贝数在1至15间中等丰度：拷贝数在100至1000间高丰度：拷贝数在1,000至10,000间27/461.文库的代表性 cDNA文库代表性指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，可用库容量来衡量，指构建的原始cDNA文库中所包含的重组子克隆数，库容量取决于细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数。cDNA文库库容量理论估算：细胞总mRNA分子数/细胞中某种mRNA的拷贝数。某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最

13、小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/14=35 71428/46经验值计算 构建一个完整的cDNA文库，不论mRNA丰度高低，都要包含任一种mRNA的cDNA克隆，最低要求的cDNA文库的库容量公式：N=ln（1-P）/ln（1-n/T）n为细胞中某种（常指最稀少）mRNA的拷贝数；T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数。P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99；N为文库中以P概率出现在细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少克隆数；29/462.序列的完整性 除代表性外，文库中基因或cDNA片段的序列完整性（

14、所含基因是否完整、是否是全长）也是反映文库质量的一个重要因素。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5端非翻译区，中间的编码区和3端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物蛋白质模板。要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。30/46cDNA文库的改良 31/461.均一化cDNA文库 cDNA文库的均一化，是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有

15、效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。32/46基因组DNA饱和杂交法 mRNA水平上，基因之间丰度差异极大；基因组水平上，基因之间拷贝数差异不大，即基因在基因组上具有拷贝数相对一致的性质。通过cDNA与基因组DNA饱和杂交降低高丰度mRNA在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放已均一化后的总cDNA，转化宿主。33/462.二级复性动力学处理 二级复性动力学是指高丰度的cDNA在退火条件下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，可以通过控制复性时间来降低丰度。用

16、羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。34/46全长cDNA文库 mRNA发生降解，第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶特性的RNase H活性变化，反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)等都可能会导致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是构建全长cDNA文库的核心。mRNA完整性的确定可通过直接检测mRNA分子的大小，或测定mRNA的转译能力。35/46目的cDNA克隆的筛选和鉴定 从cDNA文库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有核酸分子杂交和免疫学检测分析等方法。差别杂交（differential hybridization）又

17、叫差别筛选（differential screening），适用于分离在特定组织细胞或发育阶段表达的、受生长因子调节的或药物诱导表达的基因。36/46 37/46cDNA文库与基因组文库的比较（1）基因组文库克隆的是所有基因，包括未知功能的DNA序列和调控基因等，cDNA文库克隆的是所有表达的基因，即具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育和调控因子的影响。（3）基因组文库中编码的基因是真实的基因，是带有内含子和外显子的基因组基因；从cDNA文库中获得的是经过剪切去除内含子的基因。38/46可

18、获得的基因可获得的基因对比研究异常基因对比研究异常基因生物进化与同源性分析生物进化与同源性分析基因表达基因表达基因的结构功能调节研究基因的结构功能调节研究所有正在表达的基因所有正在表达的基因应用范围应用范围39/4640/46扣除文库扣除文库（subtracted library）反应不同组织细胞或反应不同组织细胞或同一组织细胞不同功能状同一组织细胞不同功能状态下，基因表达差异的态下，基因表达差异的cDNA文库。文库。41/46差示文库差示文库（differential library）差异显示反转录聚合酶链式反应（differential display of reverse transcr

19、iptional PCR，DDRT-PCR）（1）PCR扩增：所有的扩增：所有的mRNA（2）测序凝胶电泳：对比发现）测序凝胶电泳：对比发现 cDNA的差异的差异mRNA差异显示法差异显示法42/46可获得的基因可获得的基因：不同组织细胞或同一织细胞不同组织细胞或同一织细胞不不 同功能状态下表达差异的基因同功能状态下表达差异的基因。肿瘤等病因的分子机理肿瘤等病因的分子机理细胞对外因的反应细胞对外因的反应研究细胞增殖分化机理研究细胞增殖分化机理应用应用43/46Intron and Exon in Eukaryotic CellsmRNADNA53cappoly Atailexonexonexo

20、nintronintronmature mRNAProcessingTranscriptionSplicingpromotor35Take place in nucleusstart codonstop codonTo cytoplasmIntron deleted44/46cDNA Is Reverse Transcribed from mRNAmature mRNApoly A tail53TTTTReverse transcriptionCCC35353GGGDNA polymeraseRNA hydrolysis53545/46Two Libraries：cDNA Library vs Genomic LibrarymRNAcDNAReverse transcriptionChromosomal DNARestriction digestionGenes in expressionTotal GeneComplete geneGene fragmentsSmallerLibraryLarger LibraryVector:Plasmid or phageVector:Plasmid46/46