十章节甾体激素类药物分析.ppt

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1、十章节甾体激素类药物分析 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望概概 述述激素激素（HormoneHormone，荷尔蒙）荷尔蒙）-是人体是人体内各种内各种内分泌腺内分泌腺所分泌的一种生物活所分泌的一种生物活性物质。激素作用于特定的称为靶器性物质。激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用。官的组织、细胞上而发挥作用。如果如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。生病变，如甲亢、糖尿病等。v 甾体

2、激素类药物均具有甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢环戊烷骈多氢菲菲母核，基本骨架为：母核，基本骨架为：第一节第一节 基本结构和分类基本结构和分类 常用的有常用的有氢化可的松氢化可的松、醋酸可的松、醋酸可的松、醋酸泼尼松等。醋酸泼尼松等。一、肾上腺皮质激素一、肾上腺皮质激素结构特点：结构特点：A A环环3 3位为羰基、位为羰基、4 4，5 5位间为双键，形位间为双键，形成共轭体系，标记为：成共轭体系，标记为：4 4-3-3-酮基酮基（又称（又称、不饱和酮不饱和酮结构），或写成结构），或写成:4 4-C C3 3=O=O；C C环环11 11位上有羰基或羟基；位上有羰基或羟基；D D环环1717位上

3、有位上有-醇酮基醇酮基侧链侧链 （），并且多数还具），并且多数还具-羟基羟基。二、雄性激素及蛋白同化激素二、雄性激素及蛋白同化激素 （1 1）临床常用的雄性激素为）临床常用的雄性激素为睾丸素睾丸素（睾酮）（睾酮）的衍生物，如丙酸睾丸素、苯乙酸睾丸素。的衍生物，如丙酸睾丸素、苯乙酸睾丸素。（2 2）常用的蛋白固化激素有苯丙酸诺龙（苯）常用的蛋白固化激素有苯丙酸诺龙（苯丙酸去甲睾酮）、康力龙、康复龙等。丙酸去甲睾酮）、康力龙、康复龙等。（1 1）结构特征（）结构特征（两种激素之共同点两种激素之共同点）：）：A A环环3 3位位4 4-3-3-酮基酮基（又称（又称、不饱和不饱和酮酮结构）；结构）；D

4、 D环环1717位上无侧链，多为羟基。位上无侧链，多为羟基。（2 2）两种激素两种激素结构之不同点：结构之不同点：蛋白同化激素蛋白同化激素1010位上大多无角甲基，位上大多无角甲基，有的有的4 4位有卤素。位有卤素。（三）孕激素（三）孕激素 又称黄体素或孕酮，临床上主要为黄体又称黄体素或孕酮，临床上主要为黄体酮、己酸孕酮、安宫黄体酮和甲地孕酮等。酮、己酸孕酮、安宫黄体酮和甲地孕酮等。A A环环4 4-3-3-酮基酮基（、不饱和酮不饱和酮结构）；结构）；D D环环1717位上有位上有甲基酮甲基酮，有些具有羟基；，有些具有羟基；（四）雌激素（四）雌激素 临床上常用临床上常用雌二醇雌二醇及其各种酯和

5、炔雌醇及其各种酯和炔雌醇及其衍生物，以及活性的雌酮、雌三醇等。及其衍生物，以及活性的雌酮、雌三醇等。A A环为苯环，环为苯环，3 3位上有酚羟基位上有酚羟基，1010位无角位无角甲基；甲基；D D环环1717位上有羟基或羰基，有的还有乙炔位上有羟基或羰基，有的还有乙炔基。基。肾上腺皮质激肾上腺皮质激素素雄性激素与雄性激素与蛋白同化激蛋白同化激素素雌激素雌激素孕激素孕激素C C3 3C C3 3 OO4 4-3=O-3=O或或1 1，4 4-3-3OOC C3 3 OO4 4-3=O-3=OC C3 3 OHOHA A环为苯环环为苯环C C3 3 OO4 4-3=O3=OC C1010C C13

6、13有两个角甲基有两个角甲基有的两个有的两个有的一个（有的一个（C C1313 ）C C1313有一个有一个有两个有两个角甲基角甲基C C1717 醇酮基醇酮基OHOH或其或其酯酯OHOH或有或有C=CHC=CH甲酮基甲酮基第二节第二节 鉴别试验鉴别试验（一）与强酸的呈色反应（甾核）（一）与强酸的呈色反应（甾核）许多甾体激素可与硫酸、磷酸、高氯许多甾体激素可与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色，主要与酸、盐酸等呈色，主要与硫酸硫酸等呈色，机等呈色，机理可能是酮基的质子化反应。理可能是酮基的质子化反应。方法：取样品少许方法：取样品少许 观察颜色、荧光观察颜色、荧光 再观察再观察H H2 2SOSO4

7、 4加水稀加水稀释后释后一、化学鉴别法一、化学鉴别法（二）官能团的反应（二）官能团的反应1 1、C C1717 醇酮基的反应醇酮基的反应 皮质激素皮质激素C C1717-醇酮基具有还原性醇酮基具有还原性，能与许多氧化剂，如氨制能与许多氧化剂，如氨制AgNO3AgNO3、斐林斐林试剂、四氮唑盐反应。其中以试剂、四氮唑盐反应。其中以四氮唑盐四氮唑盐的的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色反应最为常用，不但可用作层析法的显色剂，还可用于含量测定。显色剂，还可用于含量测定。1 1、与碱性酒石酸铜试液反应、与碱性酒石酸铜试液反应v 铜（铜（）在碱性条件下可被还原物质还原为红色）在碱性条件下可被还原物

8、质还原为红色的氧化亚铜沉淀。如：中国药典鉴别氢化可的松的氧化亚铜沉淀。如：中国药典鉴别氢化可的松 2Cu +4OH2+-+Cu2O +H2O橙红色橙红色2 2、与氨制硝酸银试液的反应、与氨制硝酸银试液的反应v 银（银（）在碱性条件下可被还原物质还原为黑色的）在碱性条件下可被还原物质还原为黑色的金属银沉淀。如：中国药典鉴别醋酸去氧皮质酮金属银沉淀。如：中国药典鉴别醋酸去氧皮质酮2 2Ag +2OHAg +2OH+-NHNH3 3+2+2Ag +CHAg +CH3 3COOHCOOH黑色黑色3 3、与碱性四氮唑盐显色反应、与碱性四氮唑盐显色反应v 氯化三苯四氮唑（或蓝四氮唑）在碱性条件下可被氯化三

9、苯四氮唑（或蓝四氮唑）在碱性条件下可被还原物质还原为红色的单甲还原物质还原为红色的单甲鐕鐕（或蓝色的双甲（或蓝色的双甲鐕鐕）。）。H2O+OH+-+CH3COOH红色红色2 2、酮基的呈色反应酮基的呈色反应 机理：分子中机理：分子中C C3 3=O=O 和和 C C2020=O=O能与能与一般羰基试剂如：一般羰基试剂如：2 2，4-4-二硝基苯肼、异二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等显色。主要是烟肼、硫酸苯肼等显色。主要是C C3 3=O=O 与与异烟肼异烟肼缩合缩合生成异烟腙而呈黄色。生成异烟腙而呈黄色。盐酸酸性条件下：盐酸酸性条件下：4 4-3-3OO：即刻反应：即刻反应 1 1，4 4-3-

10、3OO ：1 13 3minmin C20 C20OO ：长时间：长时间3 3、甲酮基或活性亚甲基的反应、甲酮基或活性亚甲基的反应v 含含H H3 3C-C=OC-C=O（甲酮基甲酮基）和）和活性亚甲基活性亚甲基的激素类药物与亚硝基铁氰化钠、芳香醛、的激素类药物与亚硝基铁氰化钠、芳香醛、间二硝基苯反应呈色。间二硝基苯反应呈色。（1 1）甲酮基的呈色反应：）甲酮基的呈色反应：如黄体酮如黄体酮 蓝紫色，其它甾体呈淡蓝紫色，其它甾体呈淡橙色或不显色。（专属反应）橙色或不显色。（专属反应）亚硝基铁亚硝基铁氰化钠氰化钠（2 2）亚甲基的反应：）亚甲基的反应：如硫酸普拉睾酮如硫酸普拉睾酮紫红色紫红色 乙醇

11、乙醇间二硝基苯间二硝基苯氢氧化钠氢氧化钠4 4、酚羟基的呈色反应、酚羟基的呈色反应：A A环为苯环的雌激素环为苯环的雌激素+重重氮苯磺酸盐氮苯磺酸盐 红色偶氮染料。红色偶氮染料。例如：例如：+H+苯甲酸雌二醇苯甲酸雌二醇+5 5、炔基的沉淀反应、炔基的沉淀反应 含炔基的甾体激素，如炔雌醇、炔诺酮，含炔基的甾体激素，如炔雌醇、炔诺酮，遇硝酸银试液，即生成白色的炔雌醇银盐沉遇硝酸银试液，即生成白色的炔雌醇银盐沉淀及白色炔诺酮银沉淀。淀及白色炔诺酮银沉淀。6 6、卤素的反应、卤素的反应（有机氟的呈色反应）有机氟的呈色反应）一些含有氟的甾体激素药物（如醋酸氟一些含有氟的甾体激素药物（如醋酸氟轻松、醋酸

12、地塞米松等），以氧瓶燃烧后生轻松、醋酸地塞米松等），以氧瓶燃烧后生成无机氟化物，再与茜素氟蓝及硝酸亚铈起成无机氟化物，再与茜素氟蓝及硝酸亚铈起呈色反应。呈色反应。7 7、酯的反应、酯的反应 一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物来鉴别。本类药物别。本类药物C17C17或或C21C21位上羟基的酯，可发生水位上羟基的酯，可发生水解反应，生成相应的酸与醇，如为醋酸酯，水解解反应，生成相应的酸与醇，如为醋酸酯，水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙后生成的醋酸可与乙醇反应，生

13、成有香气醋酸乙酯。酯。戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，进行鉴别。己酸，进行鉴别。（一）缩氨基脲的生成（一）缩氨基脲的生成如苯丙酸诺龙（甾酮）如苯丙酸诺龙（甾酮）+缩氨脲缩氨脲 苯丙酸诺龙缩氨脲苯丙酸诺龙缩氨脲-H2O（二）酯的水解（二）酯的水解如丙酸睾丸素如丙酸睾丸素 睾丸素睾丸素醇制醇制KOHKOHH H2 2OO水解水解二、制备衍生物测定熔点二、制备衍生物测定熔点 利用甾醇、甾酮类药物与一些试剂反应生成利用甾醇、甾酮类药物与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲，或用醇制碱液水解甾体酯类生酯、肟、缩氨脲，或用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，

14、然后测定它们的熔点进行鉴别。成相应的母体，然后测定它们的熔点进行鉴别。三、紫外分光光度法三、紫外分光光度法v 一些甾体激素药物分子中存在一些甾体激素药物分子中存在和和 共轭系统，在紫外光区有特共轭系统，在紫外光区有特征吸收。征吸收。四、红外吸收光谱四、红外吸收光谱v 一般是将供试品所绘制的一般是将供试品所绘制的IRIR光谱与药光谱与药典附录中收载的标准典附录中收载的标准IRIR图谱进行对照比较图谱进行对照比较（多采用（多采用KBrKBr压片法），完全一致者即为压片法），完全一致者即为同一药物。同一药物。五、薄层色谱五、薄层色谱 主要用于甾体激素的鉴别、纯度检查主要用于甾体激素的鉴别、纯度检查及

15、含量测定前分离和制剂稳定性研究，具及含量测定前分离和制剂稳定性研究，具有简便、快速、灵敏、分离度高等优点。有简便、快速、灵敏、分离度高等优点。六、高效液相色谱法六、高效液相色谱法v 在一定的色谱条件下，比较甾体激素在一定的色谱条件下，比较甾体激素样品与其对照品峰的保留时间进行鉴别。样品与其对照品峰的保留时间进行鉴别。一般都规定在含量测定项下的高效液相一般都规定在含量测定项下的高效液相色谱图中，供试品峰的保留时间进行应色谱图中，供试品峰的保留时间进行应与对照品峰的保留时间一致。与对照品峰的保留时间一致。第三节第三节 特殊杂质检查特殊杂质检查 甾体激素类药物多由其它甾体化合物甾体激素类药物多由其它

16、甾体化合物或结构类似的其它甾体激素经结构改造而或结构类似的其它甾体激素经结构改造而来，所以可能带来原料、中间体、异构体、来，所以可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂等杂质。有些杂降解产物以及试剂和溶剂等杂质。有些杂质与该甾体激素药物结构类似，也具有一质与该甾体激素药物结构类似，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体定的药理作用而又互不相同，因此在甾体激素类药物的质量控制中，激素类药物的质量控制中，“其他甾体其他甾体”的限度检查显得很重要。的限度检查显得很重要。一、其它甾体的检查一、其它甾体的检查 我国药典和一些国家近版药典，我国药典和一些国家近版药典，采用采用TLC法或法

17、或HPLC法法检查甾体激素类药物中的检查甾体激素类药物中的“其它甾体其它甾体”。因为。因为该法具有简便、快速、灵敏、分离效果好等优点，而广该法具有简便、快速、灵敏、分离效果好等优点，而广泛用于甾体激素药物的鉴别、检查结构相似的杂质等质泛用于甾体激素药物的鉴别、检查结构相似的杂质等质量控制的方法。量控制的方法。采用高低浓度对比法进行，即供试液与对照液均为采用高低浓度对比法进行，即供试液与对照液均为同一物，但仅浓度有所不同。详见同一物，但仅浓度有所不同。详见P251252。结果判断：中国药典正文中对供试品规定了杂质斑结果判断：中国药典正文中对供试品规定了杂质斑点数目和每个杂质斑点不得超过的限量。点

18、数目和每个杂质斑点不得超过的限量。二、硒的检查二、硒的检查 本类中一些药物在后工序用二氧化硒脱氢，本类中一些药物在后工序用二氧化硒脱氢，故应检查硒。故应检查硒。三、残留溶剂检查（甲醇和丙酮的检查）三、残留溶剂检查（甲醇和丙酮的检查）此为地塞米松磷酸钠残留溶剂检查，中国药此为地塞米松磷酸钠残留溶剂检查，中国药典采用典采用GC法检查。法检查。四、游离磷酸盐的检查四、游离磷酸盐的检查 本法系利用在酸性溶液中磷酸盐中磷酸盐与本法系利用在酸性溶液中磷酸盐中磷酸盐与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再经过还原形成磷钼钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再经过还原形成磷钼酸蓝（钼蓝）在酸蓝（钼蓝）在740nm处有最大吸收。处有最

19、大吸收。第四节第四节 含量测定含量测定 常用方法有容量法、比色法、紫外分常用方法有容量法、比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法、高效光光度法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱等。其中液相色谱等。其中紫外分光光度法紫外分光光度法、四四氮唑盐比色法氮唑盐比色法、异烟肼法、铁、异烟肼法、铁-酚试剂比酚试剂比色法及色法及HPLCHPLC法在药典中均有收载。法在药典中均有收载。一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法 各国药典采用反相高效液相法测定，方法各国药典采用反相高效液相法测定，方法一般为内标法。填充剂为十八烷基硅烷化键合一般为内标法。填充剂为十八烷基硅烷化键合硅胶；流动相多为甲醇硅胶；流动相多

20、为甲醇-水、乙腈水、乙腈-水水-异丙醇、异丙醇、甲醇甲醇-四氢呋喃四氢呋喃-水等混合溶剂；检测器均为紫外水等混合溶剂；检测器均为紫外光检测器，检测波长为光检测器，检测波长为240240nmnm或或254254nmnm。为了提高分离效率、获得满意的峰形，有为了提高分离效率、获得满意的峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调节流动相的节流动相的pHpH值。值。二、紫外分光光度法二、紫外分光光度法 本类药物分子结构中有共轭体系本类药物分子结构中有共轭体系4 4-3-3-酮、酮、1 1，4 4-3-3-酮、苯环、酚羟基等结构。酮、苯环、酚羟基等结构。如皮

21、质激素、雄性激素、孕激素及口服避如皮质激素、雄性激素、孕激素及口服避孕药中有分子中孕药中有分子中、不饱和酮结构，在紫外不饱和酮结构，在紫外光区光区240240nmnm附近附近有最大吸收；具有苯酚结构的有最大吸收；具有苯酚结构的雌激素在雌激素在280280nmnm附近附近有最大吸收，均可用紫外有最大吸收，均可用紫外分光光度法测定含量。分光光度法测定含量。1 1、方法原理、方法原理 v 甾体激素甾体激素C C3 3上酮基上酮基及某些其它位置上的酮基及某些其它位置上的酮基都能在都能在酸性酸性条件下与条件下与羰基试剂羰基试剂如异烟肼、如异烟肼、2 2，4-4-二硝基苯肼及氨基脲等起二硝基苯肼及氨基脲等

22、起缩合反应缩合反应，可作为含，可作为含量测定的依据。异烟肼是目前广泛采用的一种，量测定的依据。异烟肼是目前广泛采用的一种，异烟肼（异烟肼（INHINH）试剂可与一些甾酮在酸性条件试剂可与一些甾酮在酸性条件下形成下形成黄色黄色异烟腙，在一定波长处具有最大吸异烟腙，在一定波长处具有最大吸收。收。（一）异烟肼比色法（一）异烟肼比色法三、比色法三、比色法 某些具有某些具有4 4-3-3-酮和酮和C C2020酮基的甾体酮基的甾体激素可形成激素可形成双腙双腙，如黄体酮、可的松、氢，如黄体酮、可的松、氢化可的松等。化可的松等。（二）测定方法二）测定方法 分别制备供试品、对照品溶液，再分分别制备供试品、对照

23、品溶液，再分别与异烟肼溶液反应，在别与异烟肼溶液反应，在420nm420nm波长处分波长处分别测定吸收度并计算结果。别测定吸收度并计算结果。反应原理反应原理 皮质激素皮质激素C C1717-醇酮基醇酮基具有具有还原性还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为为有色甲有色甲鐕鐕。生成的颜色随所用试剂和条。生成的颜色随所用试剂和条件的不同而定，多为蓝色或红色。件的不同而定，多为蓝色或红色。（二）四氮唑比色法（二）四氮唑比色法（一）方法原理（一）方法原理 雌激素的含量测定，曾经广泛应用雌激素的含量测定，曾经广泛应用KoberKober反应反应。该法是雌激素在硫

24、酸的作用。该法是雌激素在硫酸的作用下，通过质子化、分子重排、脱氢等作用下，通过质子化、分子重排、脱氢等作用形成共轭多烯而显色。形成共轭多烯而显色。（三）（三）KoberKober反应比色法反应比色法反应分为以下两步反应分为以下两步:被硫酸氧化而形成被硫酸氧化而形成黄色黄色产物；产物；加水或稀硫酸稀释后继续氧化最终形加水或稀硫酸稀释后继续氧化最终形成成红色产物红色产物。（二）测定方法：炔雌醇片（二）测定方法：炔雌醇片 本类药物的本类药物的药代学研究药代学研究、生物利用度研究生物利用度研究及及违禁药物监测违禁药物监测等均需测定生物样品中的甾体激素药物。等均需测定生物样品中的甾体激素药物。生物样品中

25、本类药物生物样品中本类药物的分析要求方法的专属性强、灵敏度高，的分析要求方法的专属性强、灵敏度高，因本类药物的给药剂因本类药物的给药剂量小，血药浓度很低（量小，血药浓度很低（ng级或更低）。体内有内源性的甾体激级或更低）。体内有内源性的甾体激素，故测定方法多采用素，故测定方法多采用GC、HPLC法测定，特别是采用法测定，特别是采用GC-MS、HPLC-MS法。使用法。使用MS作为检测器，分析方法的专属性和灵敏作为检测器，分析方法的专属性和灵敏度更高。度更高。采用采用GC-MS法对诺龙等法对诺龙等19种蛋白同化激素的人体代谢进行种蛋白同化激素的人体代谢进行了研究。了研究。课本课本P261有蛋白同

26、化激素有蛋白同化激素(GC-MS)及孕激素（及孕激素（HPLC）的测）的测定举例。定举例。四、生物样品中甾体激素的分析四、生物样品中甾体激素的分析几种测定方法的特点及其应用几种测定方法的特点及其应用方法名称方法名称测定基团测定基团主要试剂主要试剂甾体类别甾体类别高效液相高效液相色谱法色谱法4 4-3=O-3=O或芳香或芳香A环环C C1818柱柱甲醇（乙腈）水甲醇（乙腈）水各类甾体激素各类甾体激素紫外分光紫外分光光度法光度法4 4-3=O-3=O或或1 1，4 4-3-3O OA环为芳香环环为芳香环溶剂（无水乙醇、乙溶剂（无水乙醇、乙醇、甲醇）醇、甲醇）肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素雄性激素雄性

27、激素雌性激素雌性激素口服避孕药口服避孕药四氮唑比四氮唑比色法色法C C1717醇醇酮基酮基三苯三苯四氮唑盐四氮唑盐四氮唑盐四氮唑盐氢氧化四甲基铵氢氧化四甲基铵肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素异烟肼比异烟肼比色法色法4 4-3=O-3=O或或1 1，4 4-3-3O O异烟肼异烟肼盐酸盐酸肾上腺皮质激素、肾上腺皮质激素、雄性激素、孕酮雄性激素、孕酮KoberKober比比色法色法C C3 3 酚酚OHOHA A环为芳香环环为芳香环硫酸、硫酸亚铁铵、硫酸、硫酸亚铁铵、过氧化氢、苯酚过氧化氢、苯酚雌性激素雌性激素本本 章章 小小 结结1 1、掌握甾体激素类药物的分类及结构特征。、掌握甾体激素类药物的分类及结构特征。2 2、掌握、掌握C17-C17-醇酮基反应、酮基的呈色反醇酮基反应、酮基的呈色反应。应。3 3、掌握四氮唑盐比色法的原理。、掌握四氮唑盐比色法的原理。4 4、掌握几种含量测定方法的特定及其应用。、掌握几种含量测定方法的特定及其应用。