动物细胞培养备课讲稿.ppt

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1、动物细胞培养学学 习习 目目 标标动物细胞培养动物细胞培养定义、过程、条件、应用定义、过程、条件、应用动物体细胞核移植技术动物体细胞核移植技术定义、过程、应用、存在问题定义、过程、应用、存在问题 细胞贴壁：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿培养瓶或培养皿的的内内表面光滑、表面光滑、无毒、易于帖附。无毒、易于帖附。细胞进行有丝分裂，细胞进行有丝分裂，数量不断增多。数量不断增多。接触抑制接触抑制当贴壁细胞分裂当贴壁细胞分裂生长到生长到表面相互接表面相互接触时触时，细胞就会细胞就会停停止止分裂增殖分裂增殖，这种

2、这种现象称为细胞的接现象称为细胞的接触抑制触抑制。取出组织取出组织胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的的器官组织器官组织剪碎剪碎组织组织胰蛋白酶胰蛋白酶或胶原或胶原蛋白酶蛋白酶处理处理单个细胞单个细胞制成制成细胞悬液细胞悬液加培养液加培养液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （细胞贴壁；细胞贴壁；接触抑制）接触抑制）原代原代培养培养定义：定义：人们通人们通常将动物组织常将动物组织消化后消化后的的初次初次培养培养称为原代称为原代培养培养动物组织块动物组织块细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液原代培养（细胞贴壁；接触抑制）原代培养（细胞贴壁；接触抑制）传代培养传代培养胰蛋白酶处理分散成单个细胞胰蛋白酶处理分散

3、成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎加入培养液加入培养液用胰蛋白酶用胰蛋白酶等处理贴壁细胞；等处理贴壁细胞；分瓶分瓶继续培养。继续培养。适宜条件适宜条件 当原代培养的细胞处当原代培养的细胞处于于接触抑制后接触抑制后，用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理，使细处理，使细胞从瓶壁上胞从瓶壁上脱离脱离下来，然后加入下来，然后加入新的培新的培养液，养液，将将细胞分离稀释细胞分离稀释，并从原培养瓶并从原培养瓶内转接到内转接到新的培养瓶内新的培养瓶内，这个过程称这个过程称传传代培养代培养（分瓶培养的过程）（分瓶培养的过程）。传代培养传代培养1010代细胞代细胞5050代细胞代细胞传代传代

4、培养培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系遗传物遗传物质已改质已改变变遗传物质遗传物质未改变未改变动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理转入培养瓶转入培养瓶单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释分分 瓶瓶原代原代培养培养原代培养特点：原代培养特点：细细胞贴壁、接触抑制胞贴壁、接触抑制动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀

5、释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改遗传物质不改变，变，保持正常保持正常二倍体核型。二倍体核型。分分 瓶瓶继续传代培养继续传代培养少部少部分分细胞细胞获得不获得不死性，死性，细胞突变，遗传物细胞突变，遗传物质已经改变，质已经改变，等同等同于癌细胞。于癌细胞。细细胞胞株株：一一般般说说遗遗传传物物质质未未改改变变细细胞胞系系：遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养动物细胞培动物细胞培养的原理：养的原理：细胞增殖细胞增殖 为什么选用动物胚胎或幼龄个体为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？的器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，因为其细

6、胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。分裂能力强，分化程度低。为什么培养前要将组织细胞分散为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。积，利与细胞吸收营养。1010代以内的细胞遗传物质不代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。改变，保持正常二倍体核型。目前使用的或冷冻保存的正常目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在细胞通常在1010代以内，为什么？代以内，为什么？动物细胞培养动物细胞培养能否像能否像绿色植物组织绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目不能，

7、动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体增多，不能发育成新的动物个体。4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件1 1）无菌）无菌、无毒的环境：无毒的环境：适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度人和哺乳动物细胞最适温度为为36.50.5适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4液体合成培养基：液体合成培养基：（葡萄糖葡萄糖、氨基酸）、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加等；通常还需加血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pH

8、pH：“95空气空气+5CO2”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的；CO2维持培维持培养液的养液的p pH H。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。动物细胞培养液的主要成分是什么？动物细胞培养液的主要成分是什么？较较植物组培植物组培培养基有何独特之处？培养基有何独特之处？主要成分：主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、水、无机、氨基酸、水、无机盐、

9、维生素和动物血清等。盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1.1.液体培养基液体培养基 2.2.成分中有动物血清等成分中有动物血清等加入加入动物血清动物血清原因：原因：提供一个类似提供一个类似生物体内的环境；生物体内的环境；含营养物质含营养物质（如（如生长因子）生长因子）促进细胞发育。促进细胞发育。用用胰蛋白酶分散细胞胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质，说明细胞间物质主要成分是什么？主要成分是什么？用胃蛋白酶行吗？用胃蛋白酶行吗？在进行动物细胞培养时，用胰蛋在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明白酶分散细胞，说明细胞间的物质细胞间的物质主要是蛋白质。主要是蛋白质。动物细胞培养适

10、宜的动物细胞培养适宜的PHPH为为7.27.47.27.4，此环境下胃蛋白酶（此环境下胃蛋白酶（2.02.0）没有活）没有活性，性，而胰蛋白酶而胰蛋白酶(7.2-8.4)(7.2-8.4)的活性较的活性较高。高。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.培养正常或各种病变的细胞，培养正常或各种病变的细胞，用于用于细细胞

11、的生理、药理、病理研究胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较 在动物细胞培养过程中，下列哪种在动物细胞培养过程中，下列哪种现象是不可能的（现象是不可能的（）A A细胞一直在细胞悬液中分裂生长细胞一直在细胞悬液中分裂生长B B有少部分细胞可能在培养条件下有少部分细胞可能在培养条件下无限地传代下去无限地传代下去C C有部分细胞核型会发生变化有部分细胞核型会发生变化 D.D.个别细胞会发生基因突变个别细胞会发生基因突变A 既然动物既然动物体细胞核仍具有全能体细胞核仍具有全能性，性，为什么不能直接利用动物体细为什

12、么不能直接利用动物体细胞培育动物体？胞培育动物体？利用利用动物体细胞核移植技术动物体细胞核移植技术动物细胞的全能性会随着动物细胞的全能性会随着动物动物细胞分化程度的提高而逐渐受细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，到限制，分化潜能逐渐变弱。分化潜能逐渐变弱。怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？怎样才能使动物体细胞表现出全能性呢？1.1.定义：定义：3.分类：分类：2.原理：原理：二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞的一个细胞的细胞核细胞核，移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母细去掉细胞核的卵母细胞中胞中。使其重组

13、并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎，这这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体。用核移植用核移植的的方法得到的方法得到的动物动物称为称为克隆动物克隆动物动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性胚胎胚胎细胞细胞核移植核移植、体细胞核移植体细胞核移植胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对能性相对容易容易动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分全能性十分困难困难4.4.体细胞核移植的过程体细胞核移植的过程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛为何为何取取供体细供体细胞胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞？以内的细胞

14、？1010代以内的细胞代以内的细胞一般保持正常二一般保持正常二倍体的核型，未倍体的核型，未发生突变发生突变。受体：普通奶牛（卵母细胞采集与培养）受体：普通奶牛（卵母细胞采集与培养）受体细胞为什么受体细胞为什么选用卵母细胞？选用卵母细胞？卵母细胞体积卵母细胞体积大，易操作大，易操作；含含有促使细胞核表有促使细胞核表达全能性的达全能性的物质物质和和营养营养条件条件。为什么必须先去为什么必须先去掉卵母细胞的核掉卵母细胞的核?为使核移植动物为使核移植动物的遗传物质的遗传物质全部来全部来自自有利用价值的动有利用价值的动物提供的细胞。物提供的细胞。为什么为什么使用使用去核去核的的减数第二次分裂减数第二次分

15、裂中期细胞中期细胞（MM中中期）？期）？减数第二次分裂中期的卵母减数第二次分裂中期的卵母细胞细胞才具有受精的能力才具有受精的能力，其其内含有生物生长发育的全部内含有生物生长发育的全部信息及营养，且信息及营养，且有助于动物有助于动物细胞核全能性的表达。细胞核全能性的表达。因为在这个时候去核的话对因为在这个时候去核的话对卵细胞损伤最小卵细胞损伤最小，距离很近距离很近，便于去核便于去核。为什么不是取供体为什么不是取供体细胞核进行核移植操细胞核进行核移植操作，而是作，而是直接将供体直接将供体细胞整个细胞整个注入去核卵注入去核卵母细胞中？母细胞中？保证供核不被破坏保证供核不被破坏，使所得个体的性状使所得

16、个体的性状更符合供体。更符合供体。激活激活方法：方法：激活激活目的：目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激构建重组胚胎构建重组胚胎胚胎移胚胎移植植至至代孕代孕受体内受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩体细胞核移植方法生产体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供的克隆动物是对体细胞供体动物进行了体动物进行了100%100%的复制的复制吗？吗？为什么？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核来自供体细胞核，但核但核外还有外还有少部分少部分DNA（如线粒（如线粒体体DNA）来自）来自受体卵母细胞受体卵母细胞遗传物质遗传物质基本相同基本相同供体细胞供体细胞（供核供核）细胞细胞

17、培养培养体细胞体细胞 卵巢卵巢卵母细卵母细胞胞（MM中期中期：供质）供质）去去核核去去核卵核卵母细胞母细胞注入注入细胞细胞融合融合重组重组细胞细胞构建构建重重组胚胎组胚胎胚胎胚胎移植移植代孕代孕母体母体生出与供体奶生出与供体奶牛牛遗传遗传物质物质基基本本相同相同的犊牛的犊牛体细胞核移植的过程体细胞核移植的过程共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植受精受精卵卵体细胞核移植的原理：体细胞核移植的原理：动动物细胞核具有全能性物细胞核具有全能性卵细胞卵细胞B B母绵羊母绵羊A A母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C

18、 C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程融合后的卵细胞融合后的卵细胞黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1.1.写出写出a ba b所代所代表细胞工程名称：表细胞工程名称：a a表示：表示：b b表示表示：2.2.实施细胞工程时，实施细胞工程时，所需受体细胞大多采所需受体细胞大多采用卵母细胞的原因：用卵母细胞的原因：体积大，易操作。含有体积大，易操作。含

19、有促使细胞核表达全能性促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。的物质和营养条件。核移植核移植胚胎移植胚胎移植黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利3.3.多利面部毛色多利面部毛色是：是：根据遗传学原理根据遗传学原理说明判断依据说明判断依据：4.4.若黑面绵羊的基因若黑面绵羊的基因型为型为AAAA，白面绵羊的白面绵羊的基因型为基因型为aaaa，则克隆则克隆羊的基因型为羊的基因型为：白色白色多利多利全部的核基因全部的核基

20、因都来自都来自白面绵羊白面绵羊aa细胞核具有全能性；细胞核具有全能性；细胞质具有调控细胞细胞质具有调控细胞核发育的作用。核发育的作用。黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利5.5.多莉羊的成功多莉羊的成功证明了什么？证明了什么？胚胎移植技术胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程试管动物（婴儿）培养过程卵细胞卵细胞精子精子体外受精体外受精受精卵受精卵胚胎胚胎新个体新个体母体子宫内母体子宫内孕育、产出孕育、产出体细胞体细

21、胞核移植流程核移植流程：1.供体细胞的采集与培养供体细胞的采集与培养（10代以内）代以内）。5.用物理或化学方法用物理或化学方法激活激活受体细胞，使其受体细胞，使其完成完成细胞细胞分裂分裂和发育和发育进程。进程。6.电刺激电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，促融使供体核进入受体卵母细胞，构建构建重组胚胎重组胚胎。4.将将供体细胞供体细胞注入去核卵母细胞注入去核卵母细胞。3.显微操作显微操作去除卵母细胞中的核去除卵母细胞中的核。2.受体受体卵母细胞卵母细胞的采集与体外培养的采集与体外培养。7.胚胎移植胚胎移植入代孕母牛体内入代孕母牛体内。8.妊娠分娩与供体妊娠分娩与供体遗传物质基遗传物质基本本相

22、同相同的犊牛。的犊牛。5.5.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景1.1.在畜牧业中可在畜牧业中可以加速家畜遗传以加速家畜遗传改良的进程改良的进程。2.2.保护濒危物种保护濒危物种。3.3.医药卫生领域医药卫生领域：克克隆动物作为生物反应隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白器，生产医用蛋白；治疗人类疾病，作为治疗人类疾病，作为组织器官移植组织器官移植的供体。的供体。治疗人类疾病，作为组织器官移植治疗人类疾病，作为组织器官移植的供体的供体主要的优主要的优点是？点是？不发生免疫不发生免疫排斥反应排斥反应研究克隆动物和克隆细胞更了解研究克隆动物和克隆细胞更了解胚胎发育及细胞衰老过程；胚

23、胎发育及细胞衰老过程；克隆动克隆动物做疾病模型，更好物做疾病模型，更好追踪研究疾病追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。的发展过程和治疗疾病。6.6.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题（1 1）成功率成功率仍然仍然非常低非常低，产下的活，产下的活克隆动物比率平均不到克隆动物比率平均不到10%10%。（2 2）绝大多数克隆动物还存在健康）绝大多数克隆动物还存在健康问题，问题，许多克隆动物许多克隆动物表现出遗传和生表现出遗传和生理缺陷理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。育困难，免疫失调等。（3 3）对）对克隆动物食品的克隆动物食品的安全性问题

24、安全性问题也存有争议也存有争议。用于动物细胞培养的组织和用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自细胞大都取自胚胎或出生不久胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，的幼龄动物的器官或组织，其其主要原因是这样的组织细胞主要原因是这样的组织细胞 A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B.B.具有更强的全能性具有更强的全能性C.C.取材十分方便取材十分方便 D.D.分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D动物细胞培养要经过脱分化？为什么？动物细胞培养要经过脱分化？为什么？一般而言，动物细胞培养一般而言，动物细胞培养不需经过不需经过脱分化过程。脱分化过程。因高度分化的动物细因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去

25、了发育成完胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，物细胞定向分化，通常采用定向诱通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。的组织或器官。1 1、在动物细胞培养过程中遗传、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是物质发生改变的细胞是 A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程

26、技术的基础是 A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养AD4.4.动物细胞培养与植物细胞培养动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于的重要区别在于A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。物细胞只能培养成植株。A知识结构知识结构 动物细动物细胞培养胞培养和核移和核移植技术植技术动物细胞培养动物细胞培养动物体动物体细胞核细胞核移植技移植技术和克术和克隆动物隆动物核移植技术和克隆动物的概念核移植技术和克隆动物的概念体细胞核移植技术的过程体细胞核移植技术的过程体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题