医学免疫学酶免疫技术教学教材.ppt

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1、酶免疫(miny)技术第一页，共22页。基本概念抗原抗体反应具有高度特异性酶对底物(d w)反应具有高效催化性酶免疫技术是将两者有机的结合起来通过化学方法将酶与抗原（抗体）连接，形成酶标物抗原抗体反应后，观察酶所对应的底物(d w)显色情况检测方法具有高度特异、高度灵敏的优点按应用的实际目的分为酶免疫组织化学技术（EIHCT）用于组织切片或其他标本中的抗原定性、定位的检测酶免疫测定（EIA）第二页，共22页。酶免疫测定用于检测标本中抗原(kngyun)（抗体）定性或定量的检测 Ag-E+AbE-Ag-Ab游离(yul)的抗原、抗原抗体复合物上都有酶分子反应结束后，免疫(miny)反应的进行与否

2、及程度，通过反应体系中的酶活性来体现均相酶免疫测定特殊设计的酶标物，使反应结束后，不需分离游离和结合状态的酶标物，即可对反应作出判定非均相酶免疫测定需分离游离和结合状态的酶标物，通过检测结合状态的酶活性，对反应作出判定第三页，共22页。ELISA基本原理将抗原(kngyun)（抗体）连接在固相载体上，保留免疫学活性将抗原(kngyun)（抗体）与酶连接，形成酶标物，保留各自的活性按一定的步骤在固相载体上，分别加入待测标本和酶标物充分反应后，通过洗涤去除游离物质在固相载体上加入底物，测定底物的显色情况（肉眼、酶标仪）对待测物质作出定性或定量的判定第四页，共22页。技术(jsh)要点包被(bo b

3、i)酶结合物及底物洗涤液酶标仪第五页，共22页。包被(bo bi)将抗原（抗体）连接在固相载体上的过程称为包被固相载体的选择对蛋白质有较强的吸附力本身不参加免疫反应或化学反应空白值低、孔底透明价格低廉、来源广泛聚苯乙烯制成的微量反应板为最常用的固相载体过程确定免疫吸附剂（抗原、抗体）最适工作(gngzu)浓度将抗原/抗体用50mmol/L CB溶解至最适工作(gngzu)浓度加至固相载体上，4过夜或3726小时，洗涤用无关的蛋白质对反应板上未被占据的空隙进行封闭，洗涤，低温下保存固相Ag固相Ab第六页，共22页。酶结合物酶的选择活性高、性质稳定作用专一、受检标本对酶活性影响小易与抗原(kngy

4、un)（抗体）结合，保留各自活性检测酶活性方法简单、灵敏，底物易配制、保存酶、辅助因子及底物对人体无害酶及底物价廉、来源广泛辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）常用第七页，共22页。酶结合物HRP分子量小（40KD），易透入细胞标记方法(fngf)简单性质稳定（pH、温度、有机溶剂）易溶价格便宜、易得底物种类多内源性的过氧化物酶有干扰、某些化学物质抑制其活性标记方法(fngf)改良过碘酸钠标记法HRP-CH2-OHNaIO4HRP-CHO+H2N-IgGHRP-CH2-NH-IgG-戊二醛交联标记(bioj)法第八页，共22页。底物(d w)HRP催化(cu hu)的反应H2O2DH2

5、（无色）2H2OD（有色）ELISA中常用的底物OPDTMB保存(bocn)避光稳定不稳定，现配产物黄色、可溶蓝色、可溶，加终止液后变黄色比色波长492nm450nm免疫组化中常用的底物为DAB，被酶作用后生成棕色不溶物质第九页，共22页。洗涤液由表面活性物质吐温20（Tween20）与缓冲液组成作用增强抗原抗体的结合去除未结合的游离物质减少非特异性吸附注意事项加洗涤液后静置数秒勿溢出至其它孔，导致孔间污染(wrn)每次需将洗涤液拍干洗涤次数为45次第十页，共22页。酶标仪ELISA试验结果根据底物的显色情况加以判定按要求需用酶标仪进行检测酶标仪是通过检测反应孔中液体吸光度来判断颜色的深浅注意

6、事项比色前需加终止液常用2mol/L硫酸或盐酸目的(md)终止酶促反应、促使吸收峰转变阴性对照测定值对结果的判断至关重要已知不含待测物的标本为阴性对照品除竞争法外，结果判定为A待测/A阴性2.1待测标本判为阳性A待测/A阴性2.1待测标本判为阴性第十一页，共22页。ELISA的技术(jsh)类型检测(jin c)抗原双抗体夹心法双位点一步法竞争法双夹心法桥联法检测(jin c)抗体间接法双抗原夹心法竞争法桥联法捕获法第十二页，共22页。双抗体(kngt)夹心法原理(yunl)固相抗体酶标抗体底物显色无关抗原洗涤液如待测标本中有相应抗原最后形成(xngchng)固相抗体、待测抗原和酶标抗体复合物

7、，加底物显色，结果判定为阳性。显色深浅正比于待测抗原的浓度用于大分子抗原的检测。例：HBsAg、HBeAg第十三页，共22页。双位点一步法原理为双抗体夹心法的改良待测抗原必须具有两个以上的决定簇固相抗体、酶标抗体为分别针对待测抗原两个不同决定簇的单克隆抗体，称为双位点将待测抗原与酶标抗体同时加入反应(fnyng)孔中，为一步法注意可能出现钩状效应第十四页，共22页。钩状效应(xioyng)在ELISA双位点一步法中待测抗原(kngyun)浓度过高导致结果的假低值甚至假阴性，它不同于带现象固相抗体酶标抗体洗涤液酶标抗体底物必要时，可将标本(biobn)进行稀释，以消除钩状效应第十五页，共22页。

8、竞争法原理(yunl)无抗原固相抗体固相抗体底物底物显色(xin s)为阴性、不显色(xin s)或显色(xin s)浅为阳性，待测抗原的含量与显色(xin s)的深浅成反比。用于小分子抗原的检测第十六页，共22页。双夹心(jixn)法原理(yunl)固相抗体洗涤液无关抗原第一抗体酶标抗抗体底物显色避免(bmin)对特异性抗体的标记，但增加了操作步骤第十七页，共22页。桥联法原理(yunl)固相抗体第一抗体桥联抗体酶抗酶抗体复合物底物显色第一抗体和抗酶抗体为同一(tngy)物种的抗体、桥联抗体为抗抗体本法为非标记的酶免疫技术，避免酶对抗活性的影响，操作(cozu)简便、特异性强、灵敏度高、重复性好酶抗酶抗体复合物抗酶抗体第十八页，共22页。间接(jin ji)法原理(yunl)待测抗体酶标抗抗体底物显色固相抗原为检测(jin c)抗体常用的方法第十九页，共22页。双抗原(kngyun)夹心法原理(yunl)固相抗原待测抗体底物显色两对半检测(jin c)中，抗-HBs用此法检测(jin c)第二十页，共22页。竞争法原理(yunl)抗原(kngyun)的固相化固相抗原固相抗体Ag无待测抗体(kngt)底物显色有待测抗体底物第二十一页，共22页。捕获(bhu)法原理(yunl)抗-抗体底物显色IgM用于特异性IgM的检测(jin c)第二十二页，共22页。