基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)培训资料.ppt

《基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)培训资料.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)培训资料.ppt（59页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)发展历程1.1974年rlarckwalker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物酿酒酵母全基因组的测序。酵母菌的宿主系统1.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌2.提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3.抑制超糖基化作用的突变宿主

2、菌 4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：酵母属 如酿酒酵母克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变突突变变 产产生的异源蛋白生的异源蛋白 增加增加产产量（倍数

3、）量（倍数）作用位点作用位点SSC1 凝乳凝乳酶酶原原 Ca2+-ATPase 牛生牛生长长因子因子 3-10 转录转录后后SSC2 凝乳凝乳酶酶原原 转录转录后后 牛生牛生长长因子因子 rgrl 鼠鼠淀粉淀粉酶酶 5-10 转录转录后后osel 内啡内啡肽肽 7-12 转录转录后后NDS 人血清蛋白人血清蛋白 溶溶酶酶原活化原活化剂剂抑制因子抑制因子2型型 10 转录转录ss1l 1 抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶P 人溶菌人溶菌酶酶 10 羧肽羧肽酶酶Yrho 人溶菌人溶菌酶酶 10 转录转录 人表皮因子人表皮因子 NDE 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡

4、糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。突变类型 生物效应mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白Lys LysUbiquitin 76 aaLysLysUbiquitin ligase E3Ubiquitin ligase E3蛋白酶体如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依如果外源基因

5、表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：降解作用减少到最低程度：第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用;第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达

6、，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失;第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞株作为外源基因表达的受体细胞;在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛蛋白基因蛋白基因UBI4的表达，的表达，UBI4突变株能正常生长，突变株能正常生长，但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株低得多，因此这种缺陷株是一个理想的

7、外源基因低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因表达受体。表达受体。编码泛蛋白激活酶编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基的基因也可作为突变的靶基因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测不出泛蛋白不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编码码E1蛋白的基因蛋白的基因UBA1是一种看家基因，是一种看家基因，UBA1突突变株是致死性的，但编码变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却蛋白等位突变株却可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。此外，上述此外，上述6个个U

8、BC基因的突变也是构建重组异源基因的突变也是构建重组异源蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母UBI4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。酵母菌的载体系统载

9、体的一般结构选择标记 复制子表达盒 启动子先导序列 终止子有用的蛋白结构域1酵母菌中的野生型质粒2酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌种的野生型质粒酿酒酵母中的2环状质粒 几乎所有的酿酒酵母都含有2双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，均有类似的结构。2u质粒 几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个6318bp大小的野生型大小的野生型2u双链环状质粒，它双链环

10、状质粒，它在宿主细胞核内的拷贝数可维持在在宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之之间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染色体色体DNA完全相同。完全相同。2u质粒上含有两个相质粒上含有两个相互分开的互分开的599bp长反向重复序列长反向重复序列(IRs)，两者，两者在某种条件下可发生同源重组，形成两种不在某种条件下可发生同源重组，形成两种不同的形态同的形态(A和和B)。该质粒上共有该质粒上共有4个基因：个基因：FLP、REP1、REP2和和D其中其中FLP基因的编码产物催化基因的编码产物催化两个两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在序列之间的同源重组，

11、使质粒在A与与B两种形态中转化，两种形态中转化，REP1、REP2和和D基基因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编码基因上述基因共转录出码基因上述基因共转录出7种不同分子量种不同分子量的的mRNA分子。分子。2u质粒还含质粒还含3个顺式作用元件其中单一的个顺式作用元件其中单一的自主复制子结构自主复制子结构(ARS)位于一个位于一个IRs的边界的边界上，上，REP3(STB)区域是区域是REP1和和REP2蛋白蛋白因子的结合位点对质粒在细胞有丝分裂因子的结合位点对质粒在细胞有丝分裂时的均匀分配起着重要作用，时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于两存在于两个个IR

12、s序列中，大小为序列中，大小为50bP，是，是FLP蛋白的蛋白的识别位点。识别位点。在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决定：在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决定：第一，第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝均分给母细胞和子细胞均分给母细胞和子细胞.第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少时，时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝数水平。数水平。上述两种复制特性均与上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切蛋白的作用密切相关，这是相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得高质粒以有限的复制次数获

13、得高拷贝的主要机制。拷贝的主要机制。酵母菌种的野生型质粒 乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。酵母菌的载体系统分为三种：酵母菌的载体系统分为三种：质粒载体质粒载体 整合载体（整合载体（integrating vector）人工染色体人工染色体 酵母质粒载体又分为：酵母质粒载体又分为：酵母附加型质粒酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp)酵母复制型质粒酵母复制型质粒(yeast replicating plasmid,YRp)酵母着丝

14、粒质粒酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp)酵母附加型质粒酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特点是，该质粒被一段长度约为点是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分的反向重复序列分为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控制下的两个基因。其中一个基因为控制下的两个基因。其中一个基因为FLP，它编码一个它编码一个位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列

15、之位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重组。间的遗传重组。酵母附加型质粒酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核就是在这种质粒的基础上，加入酵母核DNA序列，以及大肠杆菌序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其的部分序列组成。故其既可以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。既可以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。酵母菌中天然存在的酵母菌中天然存在的自主复制型质粒自主复制型质粒并不并不多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因此目前用于外源基因克隆和表达的的，因此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒都是由野生型质粒和宿主染

16、色体载体质粒都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构上的自主复制子结构(ARS)、中心粒序、中心粒序列列(CEN)、端粒序列、端粒序列(TEL)以及用于转化子以及用于转化子筛选鉴定的功能基因构建而成。筛选鉴定的功能基因构建而成。酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时

17、在宿主细胞中的拷贝数很低。但是，含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十分缓慢，而且细胞的生存能力下降。整合载体：不含酵母的自主复制序列，因而不不含酵母的自主复制序列，因而不能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须能在酵母中独立复制的一种载体。这种载体必须在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因在整合到酵母染色体上才能使其上所包含的基因得到稳定表达。得到稳定表达。在啤酒酵母中含有在啤酒酵母中含有3040个拷贝的可转移的遗传个拷贝的可转移的遗传因子因子(Ty),其结构包括两个长其结构包括两个长OFR和两个长末端重和两个长末端重复序列复序列(LTR),Ty可以整合到宿主细胞的染色体上。可以整合到宿主细胞

18、的染色体上。如果在如果在Ty的的OFR2的的3端与端与LTR的的3端之间插入外端之间插入外源基因，外源基因就可以随源基因，外源基因就可以随Ty一起整合到酵母染一起整合到酵母染色体上。色体上。酵母菌克隆表达质粒的构建含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2质粒构建的杂合质粒为Yep。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌

19、克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNADNA特定序列特定序列特定序列特定序列和标记基因，和标记基因，和标记基因，和标记基因，构建出来的质粒称为构建出来的质粒称为构建出来的质粒称为构建出来的质粒称为YipYip。目的基因表达盒通常插在。目的基因表达盒通常插在。目的基因表达盒通常插在。目的基因表

20、达盒通常插在染色体染色体染色体染色体DNADNA特定特定特定特定序列中，这样目的基因就能高效序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体整合入酵母菌特定的染色体DNADNA区域。区域。酵母菌克隆表达质粒的构建含有CEN的YCp质粒的构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。酵母菌克隆表达质粒的构建含有TEL的YAC质粒的构建利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基本思路YA

21、C载体的装载量可高达800kb，适用于构建人的基因组文库。酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因酵母菌的转化程序酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。原生质转化法德一个显著

22、特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的25%-33%。酵母菌的转化程序碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有以下特性：l吸收吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。l共转化现象较为罕见。酵母菌的转化程序酵母菌电击转化酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达105转化子/gDNA。转化质粒在酵

23、母细胞中的命运l单双链DNA均可高效转化酵母菌，但单链DNA的转化率是双链的10-30倍l含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。l不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利。l同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的50-80%。用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要由营养缺陷型互补基因和显性基因两大类。营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成记忆如：Leu、Trp、His、Lys、Ura、Ade。但对于多倍

24、体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。用于转化子筛选的标记基因显性标记基因显性标记基因的编码产物只标记基因 编码产物 遗传表型Aph 氨基糖苷转移酶 抗G418Cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂利用质粒上的营养成分生物合成标记基因互利用质粒上的营养成分生物合成标记基因互补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不添加补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不添加任何筛选试剂的条件下维持转化子中质粒的任何筛选试剂的条件下维持转化子中质粒的存在，但这种筛选互补模

25、式并不稳定，而且存在，但这种筛选互补模式并不稳定，而且对选择培养基的要求也很高，在大规模传统对选择培养基的要求也很高，在大规模传统发酵中普遍使用的复合培养基一般不能用作发酵中普遍使用的复合培养基一般不能用作这种转化菌的培养。这种转化菌的培养。近年来发展起来的自选择系统是克服上述困难的近年来发展起来的自选择系统是克服上述困难的的一种有效力法。酿酒酵母的一种的一种有效力法。酿酒酵母的一种srb1突变株对突变株对环境条件极为敏感，它只能在含有渗透压稳定剂环境条件极为敏感，它只能在含有渗透压稳定剂的培养基中正常生长，而在普通复合培养基中细的培养基中正常生长，而在普通复合培养基中细胞会自发裂解。胞会自发

26、裂解。用含有野生型用含有野生型SRB1基因的自主复制型多拷基因的自主复制型多拷贝质粒转化这种突变株受体细胞，则只有贝质粒转化这种突变株受体细胞，则只有转化子能在不含渗透压稳定剂普通培养基转化子能在不含渗透压稳定剂普通培养基中生长，因此任何培养基均可用于转化细中生长，因此任何培养基均可用于转化细胞的筛选以及质粒的稳定维持。更为优越胞的筛选以及质粒的稳定维持。更为优越的是，含有的是，含有SRB1标记基因的多拷贝载体能标记基因的多拷贝载体能在受体菌中稳定复制在受体菌中稳定复制80代以上。相对化学代以上。相对化学试剂或营养缺陷互补筛选程序而言，这种试剂或营养缺陷互补筛选程序而言，这种自选择系统具有更高

27、的应用价值。自选择系统具有更高的应用价值。酵母菌启动子的基本特征和选择l用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌型启动子由基本区和调控区两部分组成，基本区包括TATA盒和转录起始位点。l调控区位于基本区上游几百碱基对的区域内，由上游激活系列（UAS）和上游阻遏序列（URS）等顺式元件组成。l利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，另一种方法是从已有的启动子中构建杂合启动子酵母菌启动子的可调控表达系统（1）温度控制性启动）温度控制性启动子子酿酒酵母有酿酒酵母有a和和两种两种单倍体，分别由单倍体，分别由MATa和和MAT两种两种等位基因决定。等位基因决定。MAT由顺反子由顺

28、反子MAT1和和MAT2组成，前者决定组成，前者决定1的激活过程，后者的激活过程，后者决定决定2阻遏过程。阻遏过程。MATa中，中，a1和和a2蛋白蛋白共同决定共同决定a1-a2阻阻遏。遏。A 25 Sir3-8tsSir3-8tshml2-1021a1MATaMATaa1hml2-102受体细胞基因组重组质粒a型 启 动子a型 启 动子型 启 动子型 启 动子酵母菌启动子的可调控表达系统（2）超诱导型启动子当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基时，其GAL1、GAL7、GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖时，启动子活性被诱导1000倍。酵母菌启动子的可调控表达系统（3）严紧控

29、制表达系统一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围，以弥补酿酒酵母的宿主-载体系统缺少的严紧控制表达机制外源基因在酵母菌种表达的限制性因素l外源基因稳态mRNA的浓度l外源基因mRNA的翻译活性l酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，磷酸甘油激酶PKG，乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的。酵母菌表达系统的选择酿酒酵母表达系统酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，

30、多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。酵母菌表达系统的选择乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌性的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。酵母菌表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶

31、基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。酵母菌表达系统的选择多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表卖弄

32、抗原在内的数种外源蛋白在该系统中成功表达。酵母菌的蛋白修饰分泌系统l蛋白质的分泌运输机制l信号肽及其剪切系统l分泌型蛋白的糖基化修饰蛋白质的分泌运输机制 酵母菌的蛋白质分泌系统与其他高等真核生物相似，高度分化的细胞器结构在酵母菌蛋白分泌运输过程中起着重要作用。内质网膜核膜高尔基体泡囊质膜信号肽及其剪切系统与其他真核生物相似，酵母菌信号肽序列的保守性较低，大都由15-30个氨基酸残基组成，含有三个不同的结构特征，即N端带正电荷的n区，中间疏水残基的h区，C端极性的c区。ln区的长度及氨基酸残基性质各异，都含正电荷。lh区的疏水氨基酸残基大都随即排列。lc区具有对应于信号肽剪切位点的特征序列。分泌

33、型蛋白的糖基化修饰酵母菌中的蛋白质糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。l进入高尔基体的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应。l酵母菌的修饰形式不同于高等真核生物。l重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中的超糖基化会造成重组蛋白的生物活性降低以及蛋白质的免疫原性增加等。乙型肝炎病毒的结构与性质乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染能力的病毒颗粒，直径42nm，基因组仅为3.2kb。病毒的主要结构蛋白石病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式，颗粒内的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白

34、。乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒以作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建利用重组酵母生产人血清蛋白人血清蛋白是血浆的主要成分，由肝脏合成，并分泌到血液循环系统中，然后散布于大多数体液中。l最初采用的重组人血清蛋白表达分泌系统是酿酒酵母。l进一步的改进方法是使用乳酸克鲁维酵母作为受体细胞，该菌体杀手毒素蛋白的信号肽能大大提高表达产物的分泌效率。l巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清蛋白的表达分泌系统。